[发明专利]鉴定牡丹授粉受精基因的VIGS沉默体系

权利要求书

1.沉默牡丹授粉受精基因的VIGS沉默体系，包含：在VIGS沉默载体上插入目的基因得到的重组载体；所述目的基因为序列表中序列1所示核苷酸序列和/或序列表中序列3所示核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的沉默牡丹授粉受精基因的VIGS沉默体系，其特征在于：所述VIGS沉默载体为烟草脆裂病毒TRV2载体。

3.权利要求1或2所述的沉默牡丹授粉受精基因的VIGS沉默体系的构建方法，包括如下步骤：

(1)利用添加了Xba I酶切位点和Sac I酶切位点的特异性引物进行PoMYB1靶片段的PCR扩增，利用添加了EcoR I酶切位点和Kpn I酶切位点的特异性引物进行PoMYB2靶片段的PCR扩增，分别得到用于VIGS沉默的PoMYB1靶片段、PoMYB2靶片段；

所述PoMYB1靶片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示；扩增所述PoMYB1靶片段的特异性引物如下：

MYB1-VF1：GCTCTAGAATTGCCACTATCACAGTCGCC；

MYB1-VR1：CCGAGCTCTCAAATATCCGTATCAGTAGAGAAGTT；

所述PoMYB2靶片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示；扩增所述PoMYB2靶片段的特异性引物如下：

MYB2-VF1：CGGAATTCTCAACGAGGAGAAAAATCACGA；

MYB2-VR1：GGGGTACCCTGACATACTTGGAGGAGCACTAG；

(2)用Xba I酶和Sac I酶将所述PoMYB1靶片段和TRV2载体进行双酶切，用EcoR I酶和Kpn I酶将所述PoMYB2靶片段和TRV2载体进行双酶切，酶切完成后将PoMYB1靶片段或PoMYB2靶片段与烟草脆裂病毒TRV2载体进行连接，连接之后转化感受态细胞，筛选阳性单菌落，然后转化到农杆菌中，即得到所述VIGS沉默体系。

4.权利要求1或2所述的沉默牡丹授粉受精基因的VIGS沉默体系在沉默牡丹授粉受精基因PoMYB1和/或PoMYB2中的应用。

5.一种沉默牡丹授粉受精基因的方法，其特征在于：使用权利要求1或2所述的VIGS沉默体系；所述方法包括如下步骤：

以牡丹带花柄的花朵为材料，注射含有所述VIGS沉默载体的菌液；

将注射后的花柄用去离子水漂洗，去除多余菌液；

将所述花柄采用水培方式进行培养，之后检测目的基因的表达水平。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述带花柄的花朵的花发育时期为紧实的花蕾。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述注射为注射花柄直到菌液从萼片处溢出为止。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：将所述花柄采用水培方式进行培养的条件为：将花柄浸于去离子水中，在温度为23℃-25℃、湿度50％-60％的条件下暗培养1天；之后转移至16h光照/8h黑暗周期、温度为23℃-25℃、湿度50％-60％的条件下正常光照培养。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述含有所述VIGS沉默载体的菌液OD₆₀₀值为1.0，注射1次。