[发明专利]一种酶法制备低分子量羧甲基脱乙酰壳多糖的方法

说明书

本发明涉及脱乙酰壳多糖衍生物的制备技术领域，具体涉及一种低分子量羧甲基脱乙酰壳多糖的制备方法。采用芽孢杆菌（Bacillus sp.）10066所产生的壳聚糖酶制备低分子量脱乙酰壳多糖，再对低分子量脱乙酰壳多糖衍生化制备低分子量羧甲基脱乙酰壳多糖。本发明提供了低分子量羧甲基脱乙酰壳多糖的制备方法。

技术领域

本发明涉及脱乙酰壳多糖衍生物的制备技术领域，具体涉及一种低分子量羧甲基脱乙酰壳多糖的制备方法。

背景技术

脱乙酰壳多糖，又名壳聚糖，是壳多糖脱乙酰基的产物，是天然的阳离子碱性多糖，具有良好的生物相容性、保湿性和成膜性，具有很好的抗菌和抑菌性，理论上讲具有广阔的应用前景，但由于其只能溶于稀酸中，限制了它的应用。

羧甲基脱乙酰壳多糖是脱乙酰壳多糖改性产物，不仅大大增加了脱乙酰壳多糖的水溶性，还保持了原有的良好性能。作为非激素类生物活性添加剂，其安全性高，具有调节免疫力、抗炎、促进伤口愈合、保湿吸湿、抑菌等功效，目前已广泛应用于医疗、化妆品等领域。

目前市场上的羧甲基脱乙酰壳多糖多为高分子量的羧甲基脱乙酰壳多糖（分子量通常大于100KDa），其溶解速度慢，溶解度低，溶解后有少量不溶物（水不溶物通常0.5~1%之间），影响溶液的澄清度（透光率通常低于80%）。另外，产品在使用过程中对终端产品的pH要求比较高，适用范围窄。因此，影响了它在很多终端产品中的应用。

而低分子量羧甲基脱乙酰壳多糖（分子量通常小于10000Da）具有溶解度高、溶解速度快的优点，且抑菌和保湿效果更好。文献报道的制备低分子量羧甲基脱乙酰壳多糖的方法通常为双氧水氧化降解高分子量羧甲基脱乙酰壳多糖，但是该法为自由基降解，具有反应进程过快不易控制，氧化副产物多等缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种低分子量羧甲基脱乙酰壳多糖的制备方法，所得低分子量羧甲基脱乙酰壳多糖分子量小于10000Da，溶解速度快，溶解性好且溶液澄清度高。并且该方法成本低、产率高、反应条件温和可控，利于工业化生产。

芽孢杆菌 10066（Bacillus sp.）是申请人提出的关于一种产壳聚糖酶的微生物菌株，申请号为201510279689.0。其中记载了芽孢杆菌 10066可用于制备壳聚糖酶。申请人惊奇的发现，芽孢杆菌 10066所产生的壳聚糖酶在制备低分子量羧甲基脱乙酰壳多糖方面亦有着优异的用途。

本发明的技术方案是：微生物菌株芽孢杆菌 10066所产壳聚糖酶在制备低分子量羧甲基脱乙酰壳多糖方面的应用。

本发明的另一个技术方案是：一种低分子量羧甲基脱乙酰壳多糖的制备方法，采用芽孢杆菌（Bacillus sp.）10066所产生的壳聚糖酶制备低分子量脱乙酰壳多糖，再对低分子量脱乙酰壳多糖衍生化制备低分子量羧甲基脱乙酰壳多糖。具体的说包括如下步骤：

步骤1：将脱乙酰壳多糖粉末与纯化水按质量比为1:12-20进行混合搅拌，然后加入等摩尔数的酸进行溶解，完全溶解后加入适量壳聚糖酶在40~50℃下进行酶解；

本步骤中，所述壳聚糖酶为申请号为201510279689.0的专利申请中说明书第0017段所记载的酶的制备方法制备。

本步骤中，所述酸选自盐酸、乙酸和乳酸。

本步骤中，壳聚糖酶的加入量为以脱乙酰壳多糖5-20U/g计算。

本步骤中，优选的酶解温度为45℃。

步骤2：酶解结束后，用截留分子量为10kDa~20kDa的超滤膜过滤，滤过液再用200Da~300Da的纳滤膜浓缩分离，加入体积为所得浓缩液体积2~3倍的95%乙醇，沉淀，抽滤，保留固体。