[发明专利]抗人AQPs自身抗体检测试剂盒及制备方法

说明书

本发明公开了一种人AQPs自身抗体检测试剂盒所需微血管和血管内皮丰富的AQPs高表达脑区切片检测组件制备，间接免疫荧光试剂盒及其应用。微血管和血管内皮丰富的AQPs高表达脑区切片检测组件制备方法为：鼠脑组织获取；制成特定脑区组织切片；检测组件制备。所述试剂盒包括微血管和血管内皮丰富的AQPs高表达脑区切片检测组件、封闭液、PBST、封片剂、荧光二抗。试剂盒可检测临床血清和脑脊液样本中抗AQP4、AQP1、及其他AQPs自身抗体。本发明试剂盒操作简单，灵敏度高，染色形态特异性强，结果判读简单、准确可靠，能够保证在对AQP4空间构象型抗体检测不低于其他手段的特异性和敏感性的基础上，补充了对AQP1和其他AQPs抗体的检测能力，满足辅助临床诊断的需求。

技术领域

本发明涉及生物医药领域中的疾病分子检测领域，具体涉及一种检测人AQPs自身抗体的间接免疫荧光检测技术，包括检测试剂盒的制备和临床血样，脑脊液样本中的AQPs抗体检测，是一种快速有效检测人自身AQPs抗体的方法，能够满足临床视神经脊髓炎谱系病和其他神经系统疾病的鉴别诊断的需求。

背景技术

水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)，是一种位于细胞膜上的蛋白质(内在膜蛋白)，在细胞膜上组成“孔道”，具有控制水和某些离子的转运的生理功能。AQPs有AQP0-AQP12等多种亚型，其中在中枢神经系统表达的有:AQP1、AQP3、AQP4、AQP5、AQP6、AQP7、AQP8、AQP9、AQP11。在星形胶质细胞和微血管、内皮高表达的AQPs有：AQP1、AQP4。

视神经脊髓炎谱系病(neuromyelitisoptica spectrum disorder,NMOSD)是一种严重的中枢神经系统脱髓鞘疾病，约75-90％的患者水通道4(aquaporin,AQP4)抗体阳性。人自身AQP4抗体的发现，是NMO成为独立疾病的重要客观证据。在最新的诊断标准中，AQP4抗体的检测，对NMOSD的及早确诊至关重要。基于不同检测基质的检测手段对抗体检出率，抗体靶位确定，对疾病的诊治都将产生影响。

目前，临床血清和脑脊液样本的AQPs自身抗体检测主要针对AQP4抗体进行，对AQP1和其他等AQPs抗体的检测仍处在以科学研究为主的阶段，而没有应用于临检工作。针对AQP4抗体的检测包括以下几种方法：1、使用表达该抗原的脊髓，中脑，小脑皮质等脑区组织切片间接免疫荧光分析(Indirect Immunofluorescence Assay,IIF)，来检测AQP4自身抗体。此方法由于所选区域的神经组织切片的染色形态较复杂，形态学特异性不够，对检验人员的要求较高，需要检验人员有丰富的神经生理学知识，才能准确识别切片中阳性信号所在的部位及意义，限制了临床检测工作。2、利用高表达AQP4抗原的细胞进行免疫荧光分析(Cell based Assay,CBA)。但此类检测方法的主要缺陷在于细胞内多种蛋白可能和待检样本结合造成的背景着色问题。在整个实验体系中，尽管有空转细胞做对照，在外源抗原表达量较低时，部分检测结果仍不易明确判读。3、基于重组抗原蛋白的酶联免疫吸附法(ELISA)。AQP4做为膜蛋白，跨膜形成的空间构象结构对自身抗体的识别至关重要，在重组蛋白的表达过程中往往因为折叠翻译不正确，形成错误的构象，影响检测的特异性，不能满足诊断指南检测AQP4空间构象型抗体的要求。

人自身抗体的检测对于自身免疫性疾病的鉴别诊断、制定针对性诊疗方案，提高诊疗水平和改善预后具有重要的应用价值。目前，AQP4自身抗体因其特异的临床意义和明确的致病性而在临床诊治中引起足够高重视，广泛认识到检测工作的重要性。而在一些新的研究，人自身AQP1抗体和NMOSD的密切关系也在逐渐引起重视，有望成为区分NMOSD和其他神经系统疾病的新的生物标志物。但目前并没有针对AQP4以外，包括AQP1在的等其他AQPs抗体检测方法和应用。本试剂盒的研发，在保证对AQP4空间构象型抗体检测不低于其他手段的特异性和敏感性的基础上，补充了对AQP1和其他AQPs抗体的检测能力。这对于NMOSD的确诊和其他自免抗体的发现具有重要意义，尤其是对免疫介导的复杂难治性神经系统疾病的诊断方向上的提示作用。

发明内容