[发明专利]一种piggyBac转座子高通量遗传筛选方法

说明书

本发明提供一种piggyBac转座子高通量遗传筛选方法，包括步骤：1)构建PB[tet‑on‑SD]载体，包含piggyBac缺陷转座子、反式四环素调控激活因子rtTA表达框和受tetO操纵子调控启动的剪接供体；2)将PB[tet‑on‑SD]质粒和编码piggyBac转座酶的质粒同时转染体外培养细胞；3)在培养基中加入四环素衍生物doxcycline药物诱导内源基因过表达；4)对细胞表型进行分析，对具有特定表型的细胞克隆进行插入突变定位，从而确定过表达后会引起特定表型的基因。本发明的piggyBac转座子高通量遗传筛选方法，能够在体外培养细胞中高效便捷地进行全基因组过表达的高通量遗传筛选。

技术领域

本发明涉及一种piggyBac转座子高通量遗传筛选方法，属于生物技术领域。

背景技术

高通量遗传筛选是通过大规模高效地突变个体或细胞的基因组，而后针对特定生物学表型对突变个体或细胞进行筛选，从而发现在该生物学过程中起作用的基因。高通量遗传筛选被广泛地用于功能基因组研究、药物靶点探索和耐药机理研究。

基因突变能造成基因功能的缺失(loss-of-function)或者获得(gain-of-function)。基因过表达是获得型基因突变的一种。目前，高通量基因过表达遗传筛选主要采用在细胞中使用慢病毒导入cDNA文库的方法。该方法涉及cDNA文库建立、慢病毒包装等步骤，操作较为繁琐。 cDNA文库的组织来源和质量直接限制了遗传筛选对基因组的覆盖度。

迄今为止，在生物学领域还缺乏一种在体外培养细胞中高效便捷地进行全基因组过表达高通量遗传筛选的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于piggyBac转座子随机诱导内源基因过表达进行高通量遗传筛选的方法。以在体外培养细胞中高效便捷地进行过表达高通量遗传筛选。

本发明采用了如下技术方案：

一种piggyBac转座子高通量遗传筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建PB[tet-on-SD]载体，包含piggyBac缺陷转座子、反式四环素调控激活因子rtTA表达框和受tetO操纵子调控启动的剪接供体；

2)将PB[tet-on-SD]质粒和编码piggyBac转座酶的质粒同时转染体外培养细胞，介导PB[tet-on-SD]载体随机插入体外培养细胞基因组；

3)在培养基中加入四环素衍生物doxcycline药物诱导内源基因过表达；

4)对细胞表型进行分析，对具有特定表型的细胞克隆进行插入突变定位，从而确定过表达后会引起特定表型的基因。

进一步，本发明的piggyBac转座子高通量遗传筛选方法， PB[tet-on-SD]载体所包含的元件从5’端到3’端依次是：

PBR：piggyBac转座子右臂；

UBC：人泛素C启动子；

rtTA：反式四环素调控激活因子；

IRES：内部核糖体进入位点序列；

puro：嘌呤霉素puromycin抗性基因；

WPRE：旱瀨肝炎病毒转录后调控元件；

PA：兔β-球蛋白polyA；

Ins：绝缘子Insulator序列；

tetO：四环素操纵子序列；

SD：剪接供体序列；

PBL：piggyBac转座子左臂。