[发明专利]基于等高微柱的开放式三维细胞培养芯片及其制备技术

说明书

本发明公开了一种可以用于三维细胞培养的芯片及其制备技术。该芯片主要由等高微柱阵列2和凹陷4组成，等高微柱阵列2的顶端面形成凹陷4。该芯片采用MEMS(Micro‑Electro‑Mechanical System)技术和复制模塑技术制备。本发明的有益效果：1)芯片包含的三维结构可以为细胞提供功能化的三维生长条件，同时由于等高微柱阵列2的存在，该芯片可以为细胞的黏附和铺展提供硬度均一的基底；2)芯片所包含的三维结构是一种开放式的三维结构，与常见显微观测技术兼容；3)芯片制备时以高硬度材料作为模板基底6，克服了软性材料容易损坏的问题；4)经各向同性微加工技术在模板基底上制备凹坑，工艺可控性高；4)经电感耦合等离子体反应(ICP)制备微柱阵列，微柱高度容易控制，避免了微柱深宽比过大时倒伏等缺陷。

技术领域

本发明涉及一种具有开放式三维结构的细胞培养芯片及制备技术。

背景技术

传统的细胞培养技术只能提供一个平坦的二维表面供细胞铺展及生长，但这种二维表面与细胞在体内的生长环境相去甚远，导致细胞在形态和功能等方面发生改变，例如：成骨细胞在体内没有增殖能力，但如果将成骨细胞分离，采用传统二维方法培养，则具有增殖能力。

鉴于上述二维细胞培养技术存在的局限性，人们提出了三维细胞培养技术：利用三维结构的生物支架材料来培养细胞，使细胞能在三维空间生长、增殖和迁移，构成三维的细胞-细胞或细胞-载体复合物。与二维培养相比，三维培养可以使细胞间具有一定的空间排列形式，细胞与支架材料之间的相互作用更加接近细胞在体内生长的真实环境。

目前多数三维细胞培养的研究都采用类于“枣糕”的封闭式结构，然后将细胞植入结构内部，期望模拟细胞在体微环境。然而这种封闭式结构不能很好地兼容常规显微观测技术。于是具有开放式结构的三维细胞培养芯片应运而生[张盈,方晔,王建国. 具有可变表面形状的细胞培养芯片:CN 2011.]。这种芯片的开放式三维结构可以很好地兼容常规显微技术，不足之处在于：1)芯片由不等高微柱组成，会导致三维结构边缘的微柱高度较高、刚度较低，无法为细胞提供足够的支撑，不利于细胞的黏附和铺展；2)芯片中的三维结构采用光阻回流工艺制备，该方法受温度、材料表面张力等因素耦合影响导致可控性差，不利于制备一致性良好的三维结构；3)该芯片的微柱直接通过光刻制备在光阻材料上，微柱高度和线宽受光刻胶及涂胶光刻工艺的耦合影响，不能很好地控制，而且每次制备芯片都需经历光刻工艺，这对工艺的复杂性和批间差异都带来了较大的负面影响；4)虽然可通过电镀工艺得到用于大规模制备的模板，但该模板由软性材料构成，多次使用后微柱结构容易损坏；

发明内容：

针对现有基于开放式结构的三维细胞培养芯片存在的表面硬度不均一，制备方法复杂且可控性差等问题，本发明提出了一种基于等高微柱的开放式三维细胞培养芯片及其制备技术。

三维细胞培养芯片由可浇铸成型的生物相容性材料制成，例如材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，芯片包含基底1、等高微柱阵列2、微坑3和等高微柱阵列2上表面形成的凹陷4。凹陷4为半椭球形，用于实现三维细胞培养，半椭球的长轴直径R和深度r应当在一个适宜的范围内，以便细胞感知到表面形状的变化，本发明中，长轴直径R应当在20-200μm的范围内，深度r应当在5-50μm的范围内；微坑3的排布可呈正四边形、正六边形或圆周形排布，以减小各微坑3之间区域5的面积，使细胞尽可能地进入凹陷4内，促使细胞在三维环境中生长。图1中显示了多个不同参数的凹陷4，但实际制备中在一个单一的细胞培养芯片内，凹陷4的长轴直径R和深度r应当具有相同的数值。基底1表面有多个微坑3，这些微坑3与凹陷4完全相同，不再赘述。图2中为方便说明，将各微坑3之间区域5与凹陷4进行了灰度梯度处理，其并不存在于实际芯片中。

等高微柱阵列2的上表面形成凹陷4，微柱直径L在1-10μm之间，高度H在1-50μm 之间，每一个微柱的高度H相同，以便为细胞生长提供一个硬度均一、适宜黏附铺展的基底。相邻微柱的距离d应在1-10μm之间，以便细胞培养液进入，同时不至于使细胞落入微柱间隙内。微柱高度H应在1-50μm的范围内，以防止微柱高度H过高导致结构变形，或微柱高度H过低无法实现三维细胞培养。