[发明专利]携带HER2/ERBB突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用

说明书

本发明是一种携带HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用，本发明的AAV/HER2是在发明人已经成功构建的腺相关病毒载体的骨架中插入HER2抗原基因得到野生型重组腺相关病毒载体，再通过点突变得到具有HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原基因的重组腺相关病毒载体。本发明的重组腺相关病毒载体及其衍生产品可用来制备免疫药物，治疗表达HER2基因的癌症。

【技术领域】

本发明涉及生物领域中的载体及其应用，特别是涉及一种携带HER2/ERBB Y1191/1192G突变基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法以及其在制备抗 HER2/ERBB阳性的肿瘤药物中的应用。

【背景技术】

HER2分子是癌基因ERBB2的编码产物,其编码基因定位于人染色体17q21, 起始于35109922位点,终末于35138436位点,基因共28 515bp,转录出全长为4 624nt的mRNA,从5′端起长238nt的序列为5′端调控区,起始密码子位于第 289～291碱基处,编码区长为3768nt,加尾信号位点在4519～4 524nt区域内,4 539～4 624nt区域为polyA。编码蛋白长1255氨基酸,前653氨基酸为胞外区, 654～675氨基酸的区域为穿膜区,676～1 255氨基酸区域为胞内区,分子量约为185 ku,是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白,属于表皮生长因子受体家族的成员。

HER2与其他受体结合成异二聚体发挥信号转导功能,相比不含HER2的二聚体信号更强；另一方面,HER2的异二聚体大大减弱了EGFR与cab1的偶联, 减少了EGFR在细胞内吞过程中的降解,促进EGFR循环回到细胞膜,使EGFR 在细胞膜过度表达,加速了细胞的增殖,导致肿瘤形成和增长加快。

HER2通过多种细胞内分子参与信号转导,其主要下游物质包括丝裂原活化蛋白(MAP)激酶、PI3激酶、C-src、Shc及Grb2等；HER2介导的胞内信号途径主要包括促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途径、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide-3kinase,PI-3K)及丝-苏氨酸激酶(AKT) 途径,HER2介导的另一信号途径为在细胞存活中发挥重要作用的PI-3K/AKT途径。HER2过表达可激活AKT及核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB),持续活化的AKT和NF-κB能导致抗凋亡级联反应,使癌细胞产生对TNF-α的抗性,降低宿主对肿瘤的防御能力。有研究显示,在MCF-7人乳癌细胞内转染入HER2基因后,可以看到DNA合成增加50％～70％,细胞生长速度增长30％～50％,软琼脂中生长速度增长225％,裸鼠中致癌性和转移能力增加。

因此，HER2蛋白是癌症主动免疫治疗的理想靶点,理论上,HER2疫苗能特异性激发细胞和体液免疫反应,使其成为抗肿瘤治疗的理想靶位。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题是：提出一种安全性高、携带人表皮生长因子2(HER2/ERBB)抗原基因的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus， rAAV)载体及其构建方法与应用。

本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：

本发明提供了一种携带HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原基因的重组腺相关病毒载体，其特征在于：将腺相关病毒载体中的腺相关病毒的结构基因替换为 HER2/ERBBY1191/1192G突变抗原基因得到的重组腺相关病毒载体。

本发明通过对该蛋白1191位和1192位用PCR法点突变，使得其在转染后能够大大降低磷酸化比例，从而降低致癌风险，但保留其免疫活性，实现预防和治疗癌症的作用。