[发明专利]一种癌症干细胞的分筛富集方法

权利要求书

1.一种癌症干细胞的分筛富集方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：制备超低吸附琼脂凝胶培养皿或多孔板；

S2：制备癌症干细胞完全培养基；

S3：制备癌症细胞的单细胞的悬液，并洗去残留血清；

S4：无血清条件下，将所述癌症细胞的单细胞接种于所述低吸附琼脂凝胶培养皿或多孔板中，并加入所述癌症干细胞完全培养基，悬浮成球培养所述癌症细胞的单细胞，获取癌症干细胞微球体；

S5：清洗使用过的所述低吸附琼脂凝胶培养皿或多孔板，再在清洗后的所述低吸附琼脂培养皿或多孔板中进行所述癌症干细胞微球体传代培养。

2.如权利要求1所述的癌症干细胞的分筛富集方法，其特征在于，步骤S1包括如下步骤：

S11：用超纯水配制1.2％-4.0％的琼脂溶液，高温高压灭菌后于40℃-50℃水浴锅维持琼脂溶液的液体状态；

S12：将所述琼脂溶液与2×DMEM/F12培养基1:1混合均匀后立刻平铺于培养皿或多孔板的底部，静置15-30分钟至琼脂凝胶完全凝固，获得琼脂凝胶浓度为0.6％-2.0％的所述超低吸附琼脂凝胶培养皿或多孔板。

3.如权利要求1所述的癌症干细胞的分筛富集方法，其特征在于，步骤S2包括如下步骤：向所述DMEM/F12中加入终浓度为15-25ng/ml的人重组表皮生长因子、终浓度为10-25ng/ml的人重组碱性成纤维细胞生长因子、终浓度为3-8μg/ml的胰岛素、终浓度为1×的B-27添加剂、终体积比为1％-15％的血清替代物、终浓度为100U/ml的青-链霉素，混合均匀得到所述癌症干细胞完全培养基。

4.如权利要求1所述的癌症干细胞的分筛富集方法，其特征在于，步骤S3包括如下步骤：将癌症组织或培养物用胰酶消化成单细胞并用磷酸盐缓冲液洗去残留的血清。

5.如权利要求1所述的癌症干细胞的分筛富集方法，其特征在于，步骤S4中所述培养是在温度为37℃、CO₂浓度为5％的培养箱中培养。

6.如权利要求1所述的癌症干细胞的分筛富集方法，其特征在于，步骤S5包括：用重力沉降法或滤网过滤法收集所述癌症干细胞微球体，并用磷酸盐缓冲液清洗所述低吸附琼脂培养皿或多孔板，将所述癌症干细胞微球体用胰酶消化成微球体单细胞并计数，将所述微球体单细胞重新接种所述低吸附琼脂培养皿或多孔板进行微球体培养。

7.如权利要求1所述的癌症干细胞的分筛富集方法，其特征在于，所述超低吸附琼脂凝胶培养皿或多孔板中琼脂凝胶的浓度由所述癌症干细胞微球体的数目、大小及癌症干细胞特异性标志物的表达情况确定。

8.如权利要求1所述的癌症干细胞的分筛富集方法，其特征在于，使用过的所述超低吸附琼脂凝胶培养皿或多孔板重复用于同一种癌症细胞的悬浮培养。

9.如权利要求1所述的癌症干细胞的分筛富集方法，其特征在于，步骤S4中将单细胞接种于所述低吸附琼脂凝胶培养皿或多孔板后起初的4天里，所述超低吸附琼脂凝胶培养皿或多孔板不能有任何的移动。

10.如权利要求1所述的癌症干细胞的分筛富集方法，其特征在于，10cm的所述超低吸附琼脂凝胶培养皿中接种所述癌症细胞的数目为1×10⁴-1×10⁵个；6孔超低吸附琼脂凝胶培养多孔板每孔接种细胞数目为500-5000个。