[发明专利]转CmWRKY15-1基因切花菊的培育、鉴定及应用

说明书

本发明属于植物基因工程及分子植物育种领域，提供包括有CmWRKY15‑1基因的重组载体、转化细胞、转CmWRKY15‑1基因切花菊的培育、鉴定方法及应用。转CmWRKY15‑1基因切花菊的培育方法包括如下步骤：（1）菊花CmWRKY15‑1基因的克隆（2）植物表达载体PBI121‑CmWRKY15‑1的构建（3）农杆菌EHA105介导叶盘法转化菊花。对转化植株进行PCR、定量RT‑PCR检测证实CmWRKY15‑1基因已整合到转基因植株基因组DNA中并发生转录。对转基因植株进行抗病性检测，转基因植株抗白色锈病能力明显提高，为选育抗病新品种菊花提供切实可行的方法。

技术领域

本发明属于植物基因工程及分子植物育种领域，涉及一种通过转CmWRKY15-1基因提高菊花抗白色锈病能力的方法，具体涉及转CmWRKY15-1基因的重组载体、转化细胞、转CmWRKY15-1基因的切花菊的培育鉴定及应用。

背景技术

菊花（Chrysanthemum morifolium）是我国十大名花之一，种类丰富，被广泛的应用于园林绿化及切花生产中。不同品种菊花的性状差异较大，很多观赏性强、经济价值高的菊花不能够兼具良好的抗逆性及抗病性。分子植物育种的诞生，为快速高效的选育出具有优良性状的菊花提供了新方法，其可通过转基因技术手段，将特定的基因整合到植株的基因组中，从而改变植物的生物学特性，获得具有特定性状的转基因植株。

WRKY转录因子是植物十大转录因子家族之一，最初由Ishiguro等人在甘薯中发现（1994），后来相继有学者研究发现WRKY转录因子参与到植物的抗生物胁迫及非生物胁迫响应中，增强植物自身的抗病能力及抗逆性。目前已发现在拟南芥、烟草、水稻等植物中过表达WRKY基因能够增强植物的耐盐性、耐旱性和耐寒性等抗逆能力。另一方面，WRKY转录因子能够通过直接调控抗病基因的表达或参与激素介导的信号转导途径从而改变植物的抗病能力。在拟南芥中，WRKY基因能够增强其对野火病菌、灰霉病菌、青枯病菌、枯萎病菌等病原菌的抗性（Deslandes et al.，2002；Xu et al.，2006；Le Roux et al.，2015；Karim etal.，2015）。在水稻中，过量表达WRKY基因能够显著提高水稻对稻瘟病和白叶枯病的抵抗力（Encinas-Villarejo et al.，2009；Jing et al.，2009）。此外，WRKY基因还能够抗番茄叶卷曲病（Mandal et al.，2015）、葡萄霜霉病（Merz et al.，2015）、白粉病（乔恒波，2016）、柑橘溃疡病（周鹏飞等，2017）等多种植物病害。在菊花中，关于WRKY基因功能的研究尚不多见。DgWRKY5和CmWRKY1基因能够增强菊花的耐盐性和耐旱性（田效琴，2016；范青青，2016）。在菊花中过表达CmWRKY48基因和CmWRKY15基因，增强了菊花对蚜虫的防御机制和对黑斑病的敏感性（Li et al.，2015；范青青，2016）。

菊花白色锈病是菊花重要病害之一，其传播范围广、危害性大，一旦发病将使植株叶片干枯下卷甚至变黑，引起大规模植株死亡（Whipps et al.，1993）。目前，关于WRKY基因增强菊花抗白色锈病的能力的相关研究尚未见报道。

针对目前实际生产中菊花抗白色锈病能力较弱，且尚未有相关研究提供WRKY基因增强菊花抗白色锈病能力的理论依据，本发明提出一种转CmWRKY15-1基因切花菊的培育、鉴定方法及应用。

参考文献：

1.Ishiguro S, Nakamura K. 1994. Characterization of a cDNA encoding anovel DNA-binding protein, SPF1, that recognizes SP8 sequences in the 5’upstream regions of genes coding for sporamin and beta-amylase from sweetpotato[J]. Mol. Gen Genet, 244(6): 563-571.