[发明专利]一种能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因及其应用

说明书

本发明公开了一种能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因即MSTN突变基因。所述MSTN突变基因是在MSTN基因第一内含子上敲除几个碱基序列。该MSTN突变基因能够促进牛骨骼肌产生双肌现象。还公开了该MSTN突变基因的应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的基因工程技术，具体涉及一种肌肉抑制素基因密码子及其应用，更具体涉及一种能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因(即MSTN突变基因)及其应用。

背景技术

MSTN是一种肌肉抑制素基因，属于TGF-β超家族，它的合成主要是由骨骼肌完成，属于多肽中的分泌型，作为TGF-β超家族的成员，它具有与这个家族共同的生物结构：包括位于N-末端的分泌信号肽、蛋白酶水解位点(proteolytic processing site，RSRR)和位于C-末端的成熟肽区，含有半胱氨酸(cystine knot)结构，这些组件组成一个52kDa的没有活性的前体蛋白，通过中间的蛋白水解位点的加工后才可形成一个26kDa的活性肽，从而发挥该有的生物功能。MSTN基因cDNA的组成：1个可读框(ORF)、3个外显子、2个内含子的核苷酸序列。

1997年Mcpherron等人在筛选小鼠的肌肉cDNA文库首次发现myostatin(MSTN)基因，同年Grobet等人对自然双肌的比利时兰牛进行了测序，结果发现比利时蓝牛MSTN的p.D273RfsX13发生了纯合突变，从而引起双肌性状。1999年，Carlson等人也发现若大量的MSTN存在于骨骼肌中会使得肌肉生长受到抑制，形成肌肉萎缩，同时Lee等人则发现该基因由特定的肌肉组织产生，调节肌肉组织的生长，该基因缺失后，会使一些动物出现双肌现状。此后，人们开展了一系列与MSTN相关的研究，发现MSTN突变小鼠除了出现双肌性状，还可以以肌肉再生增强以及纤维化程度降低的方式提高肌肉愈伤能力；糖的消耗和糖摄入加强，对胰岛素的敏感性加强；心脏增大且压力应激增强；脂肪含量减少，脂肪的发生也会受到抑制，且白色脂肪向棕色脂肪转变加强从而促进机体的生热作用；骨密度、骨矿物质含量也会有所增强，同时还可以可增加骨痂、骨折的尺寸和强度而加快骨折后的愈合。通过调控胎盘的建立和葡萄糖的摄入，以此来调控子宫平滑肌细胞和内膜上皮细胞的增殖及乳腺的发育，参与雌性哺乳动物的生殖调控。

CN102653764B公开了一种在牛MSTN基因中引入移码突变的方法，其构建了一个牛MSTN基因移码突变的打靶载体，通过同源重组将移码突变引入牛MSTN基因第3外显子；首先合成出包含移码突变的MSTN同源短臂，使其在第3外显子上缺失11bp，形成移码突变；然后合成MSTN的同源长臂，利用酶切位点插入载体pFPC-1，构建出牛MSTN基因移码突变的打靶载体pFPC-MSTN，得到的打靶载体线性化后转染牛体细胞，通过同源重组在牛MSTN基因中引入移码突变，利用这种细胞可以在生产中得到MSTN基因移码突变的转基因牛，从而提高其产肉性状，提高牛肉的品质与产量。

CN103088044B公开了一种敲除牛肌肉生长抑制素MSTN基因的启动子捕获型打靶载体，其为PIII MSTN，包含MSTN基因上下游同源臂3’同源臂和5’同源臂，所述5’同源臂的最后一个碱基为MSTN第一外显子起始密码子上游最后一个碱基，在同源臂之间还具有标记基因；所述5’同源臂核苷酸序列如SEQ ID NO：1的8824～10133；3’同源臂核苷酸序列如SEQID NO：1的15091～21957；所述标记基因包括报告基因EGFP和带有启动子PGK的新霉素抗性选择基因Neor；该打靶载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

CN106119283A公开了一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除MSTN基因的方法，该方法通过对多物种进行同源对比选取两对MSTN基因靶序列，利用gRNA的PAM设计原则，合成两对靶序列不同，表达的蛋白相同，带有相同BsmBI粘性末端的DNA双链，将双链与pPDNA330质粒进行连接得到携带有多物种的MSTN同源基因的重组载体，重组载体利用荧光蛋白表达法对基因敲除效率进行检测，选择敲除效率更高的载体转染多物种受体细胞，进行基因敲除并验证。