[发明专利]一种脑组织羰基化蛋白质提纯方法

说明书

本发明属于生物样品的提纯制备领域，具体是涉及到一种脑组织羰基化蛋白质提纯方法，包括如下步骤：将含有羰基化蛋白质的样品和生物素酰肼混合，反应后，离心分离，得到生物素‑蛋白质；将生物素‑蛋白质和氰基硼氢化钠混合，过滤，然后用磷酸盐缓冲液超滤，得到蛋白质溶液；将蛋白质溶液和亲和素混合，离心，得到链接有亲和素的蛋白质溶液；将链接有亲和素的蛋白质溶液用D‑生物素洗脱，离心，分离，除去D‑生物素，洗涤，得到提纯后的羰基化蛋白质。本发明不需要通过电泳，提纯得到的羰基化蛋白质直接上机进行质谱鉴定与分析，可以分析出蛋白质氧化的情况，本发明提纯的是一类在体内被羰基化的蛋白质，而不是总蛋白，方便进行蛋白质组学分析。

技术领域

本发明属于生物样品的提纯制备领域，具体是涉及到一种脑组织羰基化蛋白质提纯方法。

背景技术

自由基对机体的氧化损伤大致分为5个方面：(1)对抗氧化系统的损伤；(2)对DNA的氧化损伤。(3)对脂质的氧化损伤，近几年发现的8.异前列腺素F2a(8-iso.PGF2a)是自由基损伤细胞膜脂质更好的指标；(4)对蛋白质的氧化损伤；(5)对糖类的氧化损伤，反映自由基对糖影响的标志物目前还不多，常用的指标有透明质酸。蛋白质不仅是生物体的重要组成成分，而且在生命活动中担负重要的功能，在生物体中有催化、调节、转运、贮存、运动和支架作用等功能。对蛋白质氨基酸侧链的氧化可导致羰基产物的积累。蛋白质的羰基化被广泛地用于评价各种生物有机体的氧化程度，蛋白质羰基含量是蛋白质氧化损伤的敏感指标。

羰基应激是指生物体系中活性羰基类物质(reactive carbonyl species,RCS)的产生超过了机体的清除能力，从而导致蛋白质等生物大分子的羰基化修饰，使生物大分子发生结构改变和功能丧失，导致细胞和组织功能紊乱，最终出现机体病理生理改变和加速衰老过程。蛋白羰基被认为是氧化应激的一个通用指标，是蛋白质氧化的主要形式。蛋白羰基是蛋白质的非酶促不可逆羰基修饰：⑴羰基可以通过氨基酸侧链氧化(脯氨酸、精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、谷氨酸和天冬氨酸残基在蛋白质中直接形成或通过α-酰胺或二酰胺途径氧化裂解多肽主链；⑵蛋白质也可以是脂质过氧化产物间接羰基化，如4-羟基-2-壬烯醛、2-丙稀醛和丙二醛通过Michael和/或Schiff碱加成到半胱氨酸，组氨酸或赖氨酸残基；⑶通过形成蛋白质糖基化终产物(AGEs)和被自由基氧化的蛋白质所形成的羰基化蛋白等。也就是说在身体内蛋白质被氧化成为羰基化蛋白质，或者说蛋白质羰基化。

提取并纯化这些羰基化的蛋白质，就可以分析哪些蛋白质被氧化，有利于分析衰老和蛋白质之间的相互关系。但是目前并没有一个比较好的方法提取并纯化这些蛋白质，以方便分析。

申请号为201110204843.X的专利，公开了一种用于蛋白质组学分析的动物蛋白质样品的制备方法，包括如下步骤：

(1)组织标本获取：剥离蚯蚓的表皮组织，清洗、用滤纸吸去多余液体，所得组织标本于液氮中速冻后移至-80℃冰箱保存；

(2)冰冻切片：组织标本从-80℃冰箱取出后，用-30℃的冰冻切片机切片，切片厚度10μ m，每例标本第1张切片用HE染色，以后每张切片只做苏木精染色；

(3)显微捕获切割：将制备好的染色切片放在显微镜的载物台上，直视下比较观察选定要切割的区域，按最大捕获效率设定参数，具体为：光束直径60μm，光束能量80mV，激传递脉冲为1.6ms，捕获切割取得40000～50000个细胞，通过软件对所获取的细胞计数；

(4)样本制备：切割下来的细胞加入组织裂解缓冲液中，冰浴振荡30～40min，再1～5℃下超声处理2～5次后，离心，取上清，即得蚯蚓蛋白质样品，贮存于-80℃冰箱备用；所述组织裂解缓冲液组成如下：8mol/L尿素，2mol/L硫脲，4％CHAPS，65mmol/LDTT，0.2％两性电解质，10ml/L cocktail。

中国申请号为201510206905.9的专利公开了一种小鼠脑组织蛋白质组分析的样品制备方法，包括以下步骤：