[发明专利]玉米茎腐病抗病分子育种方法及其应用

说明书

本发明涉及分子生物学，具体公开了一种玉米茎腐病抗病分子育种方法及其应用。本发明提供的与玉米茎腐病抗性相关的KASP分子标记可用于茎腐病抗病分子育种和玉米种质资源分析，同时具有成本相对较低和应用灵活性高的特点，可实现高通量检测。所述分子标记为JFB‑3，JFB‑4，JFB‑5，JFB‑6，JFB‑7，JFB‑8或JFB‑9，可由SEQ ID NO.8～28所示的引物分组扩增得到。

技术领域

本发明涉及分子生物学，具体地说，涉及与玉米茎腐病抗性相关的KASP分子标记。

背景技术

玉米茎腐病，也叫茎基腐病，是世界玉米产区普遍发生的一种重要的真菌性土传病害。近年来茎腐病在我国部分地区发病较为严重，根据广西、浙江、湖北、陕西、河北、山东、辽宁等18个省区调查，发病率一般在10％-20％之间，严重年份可达50％-60％，减产约20％，重者甚至绝收。发病时期一般从玉米灌浆期开始，乳熟后期至蜡熟期为发病高峰期。发病时一般从根部开出现腐烂，然后病情往上蔓延出现明显病叶青枯至全株枯萎，节间变淡褐色，果穗苞叶青干，穗柄柔韧，果穗下垂，不易掰离，穗轴柔软，子粒干瘪，脱粒困难。玉米茎腐病在乳熟后期，常突然成片萎蔫死亡，因枯死植株呈青绿色，故也称青枯病。从最初出现病叶到全株出现发病症状一般在一周左右，历时时间短的仅1-3天，长的可达15天以上。

目前玉米茎腐病的抗病鉴定主要有田间自然发病鉴定和人工接种鉴定。田间自然发病鉴定主要是在茎腐病高发病区进行田间自然鉴定。人工接种鉴定利用茎腐病病原菌侵染玉米植株，将病原体均匀的接种于根部附近，在玉米乳熟末期、成熟期调查病株率与病级。

玉米茎腐病田间表型的鉴定主要是以发病率和病级两种方法，发病率是发病株占总株数的百分比，病级则是指植株个体的受害程度。如分别以1、3、5、7、9级分别代表抗性级别极弱、弱、中、强、极强5个抗性评价的标准，则1级的表型：全株枯死且倒伏，茎基部维管束破裂，籽粒干瘪；2级的表型：株叶片出现典型青枯症状，茎基部明显变软但不倒状，果穗下垂，籽粒不饱满；3级的表型：全株叶片出现典型青枯症状，茎基部变色且稍有水浸状，果穗基本正常；4级的表型：全株叶片出现青枯症状，茎基生长正常，果穗生长正常；5级的表型：全株生长正常，中下部叶片出现青枯/青黄枯症状，茎基生长正常，果穗生长正常。

实践证明，种植抗病品种是防治此病经济有效的根本措施，而且我国抗源丰富，为选育工作和利用抗病品种提供了保证。同一玉米自交系对茎腐病的抗性，只有不同地区和不同自然条件下都能保持一定的抗性水平，其抗病性才能稳定可靠，用其为亲本所配制的杂交种在生产上才能有较好的抗病性能。因此在常规育种中往往需要多年多点的鉴定才能确定育种材料对茎腐病的抗性级别，这大大增加了品种选育的时间和成本，而通过分子标记的手段直接筛选出抗茎腐病的育种材料可以在很大程度上提高育种效率。分子标记辅助选择利用与抗病QTL紧密连锁的分子标记对群体中含有抗病QTL的单株进行追踪，用标记的基因型来确定单株的抗病性。

SNP标记是在基因组中分布最为广泛的分子标记，其二等位基因的性质使SNP标记的检测容易实现高通量和自动化，目前在玉米研究领域，SNP标记也已经开始得到广泛应用，以SNP标记为基础的抗病辅助育种是玉米分子育种研究和应用的重要领域。KASP是竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR)的缩写，可在广泛的基因组DNA样品中(甚至是一些复杂基因组的DNA样品)，对SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断。实验流程主要包括：

1、准备：1)两条末端碱基不同的等位基因正向引物与一条反向引物构成的PrimerMix，两条正向引物5’端分别连有不同序列的检测引物序列；2)带有不同荧光的两条检测引物Master Mix；3)DNA模板；

2、PCR反应：1)变性模板与Primer Mix中相匹配的引物结合并退火，延伸后序列被加上了检测引物的序列；2)等位基因特异性的末端序列的互补链合成；3)信号产生-特异序列对应的检测引物随PCR反应进行指数性增长，相应信号被检测。