[发明专利]一种菌根真菌印度梨形孢的长期保存方法

说明书

本发明提供一种菌根真菌印度梨形孢的长期保存方法，该方法是通过将菌根真菌印度梨形孢接种于无菌的兰科根部，通过优化保存培养基，实现常温下长期（12个月）保存的目的，相对传统平板培养基保存，具有可在常温下长期保存，减少因频繁继代带来的污染与菌源变异的风险，同时，通过恢复培养基培养，可迅速获得分离具有共生能力的菌株。

技术领域

本发明属于微生物应用领域，具体涉及一种菌根真菌印度梨形孢的长期保存方法。

背景技术

印度梨形孢(Piriformospora indica )是从印度的塔尔沙漠中分离出来的一种植物根部内生真菌，属担子菌门（Basidiomycota），层菌纲（Agaricomycetes），蜡壳耳目（Sebacinales），蜡壳耳科（Sebacinaceae），梨形孢属（Piriformospora），是一种能够定殖在多种寄主植物根部的内生真菌，它的作用和丛植菌根真菌非常相似，能促进植物生长，加快植物对氮、磷等矿物质的吸收，提高作物逆境胁迫的忍耐性，诱导植物产生系统抗性等。

印度梨形孢可以不通过寄主植物而在人工培养基扩增与保存，传统方法常保存于PDA等培养基，具有易失去活力的特点，常温下2-3周就需继代一次，4-6℃冰箱低温保存也需要2-3个月继代一次。频繁继代除带来人工成本，还易造成菌源污染与变异。同时，印度梨形孢因长期保存于人工培养基，可能丧失与植物根部共生的能力。

为了减少继代培养操作，保持印度梨形孢较高的共生能力。本发明利用印度梨形孢可定殖于兰根薄壁细胞，且兰科植物生长慢的特点，通过优化保存培养基，恢复培养基，公布了一种将印度梨形孢接种于无菌的兰科根根部，实现常温下长期保存的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种菌根真菌印度梨形孢的长期保存方法，实现常温下长期保存的方法。

本发明是由以下技术方案实现的，其具体步骤如下：

1、印度梨形孢菌保存培养基制备

每升保存培养基添加1/2MS基本培养基、蔗糖10-15g/L、甘露糖15-20g/L，琼脂粉5-6g/L，蒸馏水定容，煮沸，稀盐酸调pH值至5.8，分装于625 mL兰花瓶，每升培养基分装9-11瓶，以覆有0.5 cm透气孔的透气膜或透气盖封口，以121℃高压蒸汽灭菌方式灭菌20min，冷却备用。

2、无菌兰科植物制备

在无菌环境下，将无菌的带有根部的兰科植物茎段或小苗接种于所述保存培养基，置于20-28 ℃，2000lx、14 h/d光照条件，培养7-10 d备用。

3、接种与保存

在无菌条件下打开2所述兰科植物培养瓶，用打孔器把于PDA培养基新培养一周的印度梨形孢菌菌环周围具活力的菌块接种至兰科植物根部，菌块距离兰科植物根部0.5-1cm处，接种后置于28℃、黑暗条件培养4～5天，转入20-28 ℃，2000lx、14 h/d光照条件，培养保存。

4、恢复培养基制备

每升恢复培养基添加1/2MS基本培养基、蔗糖10-15 g/L、香蕉泥50-100 g/L，琼脂粉5-6 g/L，蒸馏水定容，煮沸，稀盐酸调控pH值至5.8，分装于625 mL兰花瓶，每升培养基分装9-11瓶，透气盖封口，以121℃高压蒸汽灭菌方式灭菌20 min，冷却备用。

5、恢复培养

将明显具有共生特征（根毛变多）植物茎段、植株或根部接种于4所述恢复培养基，转入20-28 ℃，2000lx、14 h/d光照条件，培养保存。培养1周可见从菌根部长出幅射状白色菌块。

6、检测