[发明专利]基于标签小分子专属分离-放大的LC-MS检测体内蛋白药物的定量方法及应用

说明书

本发明涉及一种应用于生物样品中痕量蛋白药物的高特异、高灵敏检测的分析方法，以凝血酶为研究示例，构建的功能化磁性纳米粒子特异性捕获样品中凝血酶，继而与表面同时修饰大量标签小分子和特异性结合蛋白的适配体的双功能化纳米金探针构成三明治夹心式复合物，基于此三明治结构，实现了检测靶标的转化，即以标签小分子代替蛋白药物作为进一步的质谱检测，规避了质谱直接检测蛋白大分子的响应低等困难，同时通过三明治夹心结构的构建，引入大量的与待测靶蛋白成比例的标签小分子，进一步实现了检测信号的放大，此外结合三明治夹心结构的高特异性及LC‑MS/MS的高灵敏度，建立了灵敏高效的无需蛋白酶水解的直接以LC‑MS/MS测定蛋白药物浓度的新方法。本发明的制备方法简单，操作简便，经济有效，快速灵敏，为LC‑MS/MS检测体内蛋白药物开启了新篇章。

技术领域

本发明属医药领域，具体涉及一种基于生物条码专属分离-放大-无蛋白酶解预处理的LC-MS/MS检测体内蛋白药物的定量方法。

背景技术

近来，越来越多的蛋白药物被开发并应用于疾病的诊断及治疗，在医药发展中展现明显的优势，已成为当今新药研究中发展迅速的热点领域之一。为促进蛋白药物的发展及生物的应用，正确评价蛋白药物的体内药代动力学为重要的研究环节。然而蛋白药物生物活性高、靶向性强，所需用药剂量小，存在体内浓度低，易受内源性物质干扰等问题，对传统的分析手段提出较大的挑战。本发明旨在探索新型的灵敏、专属、高效的检测体内蛋白药物的定量分析方法。

目前，传统公认的体内蛋白检测方法主要为酶联免疫吸附测定法及放射免疫测定法等，但仍存在定量范围窄、选择性较低、价格昂贵等缺陷。适配体是经指数富集的配基系统进化技术(SELEX)从随机单链核酸序列库中筛选处特异性与靶物质高度亲和的核酸单链。较传统方法所采用的用于特异性捕获富集生物样品中的待测蛋白药物的抗体，适配体具有易于合成及修饰，稳定性好，成本低等优势，被广泛应用于离子、小分子及大分子的分离识别。

在过去的几十年中，纳米材料作为一种新兴的先进材料引起了广泛分析研究者的关注及研究。其中磁性纳米粒子具有超顺磁性、高比表面积、高吸附能力、便于快速分离、可重复利用及修饰简便等特点，被大量运用于生物大分子、小分子等的分离分析，对于易受生物样品基质干扰的生物大分子待测物具显著的优势。将功能化适配体化学修饰于磁性纳米粒子表面，可以用于生物大分子的特异性分离富集，从而避免生物样品基质的干扰同时进一步提高检测的灵敏度。

LC-MS/MS是目前小分子药物体内分析的主要方法。该方法具有灵敏度高、线性范围宽及可同时进行多个成分定量分析等优点。但该检测方法在生物样品中蛋白药物的定量分析中的应用仍面临许多挑战，其中蛋白药物的离子化效率较低、质谱检测信号弱为最大的局限。目前采用蛋白酶解法将蛋白药物进行酶解后选取几个特征肽段对其进行定量分析，但该技术只是将蛋白药物转化为离子效率较蛋白药物略高的特征片段进行分析，所达到的检测灵敏度的仍不能满足低浓度蛋白药物的检测。同时蛋白酶解的过程耗时长过程复杂，对操作要求较高，易引入较大的误差。因此应用LC-MS/MS检测体内蛋白药物浓度仍为医药研究领域待攻克的难点。

发明内容

本发明的目的之一在于以适配体-蛋白药物特异性结合反应为基础，通过功能化磁性纳米粒子探针和双功能纳米金探针表面的适配体捕获和识别蛋白药物，形成“三明治”夹心式复合物，引入外加磁场，实现待测蛋白药物的专属性分离、纯化和富集。同时，通过调控纳米金粒子表面的标签分子与适配体的分子数的比值实现标签分子的定量放大功能。采用LC-MS/MS测定“三明治”夹心式复合物的纳米金粒子表面所释放的标签分子，规避了LC-MS/MS直接检测蛋白药物的缺点，同时实现提高灵敏度的目的。

以功能化纳米探针为基础，特异性识别和分离生物样品中蛋白药物，无需蛋白酶解以LC-MS/MS直接高灵敏检测标签分子实现信号增敏目的的蛋白药物高灵敏分析定量的新方法，技术方案具体如下：