[发明专利]一种肺癌耐药细胞系及其制备方法

说明书

本发明涉及耐药细胞系领域，特别涉及一种肺癌耐药细胞系及其制备方法。一种肺癌耐药细胞系的制备方法：肺癌细胞接种于含有21‑93nM肺癌靶向药的培养基中培养，至细胞在该浓度下正常存活和增殖；以50nM的浓度差提升进行培养；至细胞增殖抑制浓度达到IC50的4倍时，按每100nM的浓度差提升进行培养；药物筛选浓度达到IC50的8倍时，按每1μM的浓度差提升培养，直至肺癌细胞能够在10μM奥希替尼的细胞培养体系中维持存活和增殖时，得到肺癌耐药细胞系。该方法在逐步提高培养基中药物浓度的基础上制得耐药细胞系，为后期模拟临床药物耐药，研究肺癌靶向药物耐药机制，研发有效的抗癌药物提供基础。

技术领域

本发明涉及耐药细胞系领域，具体而言，涉及一种肺癌耐药细胞系及其制备方法。

背景技术

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，可分为小细胞肺癌和非小型细胞肺癌，其中非小型细胞肺癌约占全部肺癌的80％。据2017年国家癌症中心发布，肺癌已成为中国发病率和死亡率最高的癌症，且大多数患者确诊时已经为晚期。晚期肺癌的治疗多是通过化疗手段，但是由于肿瘤细胞的异质性、多变性等特点，导致许多肿瘤患者对化疗药物不敏感，或者在化疗过程中逐渐对药物产生耐受性，从而导致肿瘤的复发或患者的死亡。肺癌肿瘤的耐药发生主要是因为表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)突变，针对EGFR的突变，临床上主要是应用酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinaseinhibitors，TKIs)来治疗，但是一段治疗之后又会发生新的耐药，因此，针对耐药后肺癌的治疗显得尤为重要。

奥希替尼(osimertinib，AZD9291)是继EGFR-TKI耐药后疗效显著的第三代靶向药物，可同时对付非小细胞肺癌的EGFR基因突变(包括18，19，21号外显子突变)和EGFR-TKI获得性耐药(T790M)，为晚期肺癌患者延长了生命，但是，不可避免的是一段时间后肺癌患者仍会发生耐药。

目前针对肺癌的EGFR-TKI耐药研究主要涉及到PI3K/Akt/mTOR、Ras/Erk及Jak-STAT3等信号通路，但随着耐药的发生，研究有效的药物靶点就显得尤为重要。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种肺癌耐药细胞系的制备方法，以肺癌H1975、HCC827细胞为对象，将AZD9291以逐步增加药物浓度法建立耐药细胞系，试验步骤简便易行，便于产业化制备。

本发明的第二目的在于提供上述制备方法制得的肺癌耐药细胞系，该耐药细胞系为后期模拟临床药物耐药，研究肺癌靶向药物耐药机制，研发有效的抗癌药物提供基础。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种肺癌耐药细胞系的制备方法，包括以下步骤：

(a)、对数生长期的肺癌细胞接种于含有21-93nM肺癌靶向药的培养基中培养，细胞恢复至正常生长时，再次加入相同浓度的药物，直至细胞在该浓度下正常存活和增殖，以此作为一个培养循环；

(b)、以50nM的浓度差提升进行培养，处理20-28h后，更换无药物浓度的培养基培养24h-72h，以此为一个循环，直至在相应药物浓度下细胞正常生长；

(c)、至细胞增殖抑制浓度达到IC50的4倍时，按每100nM的浓度差提升进行培养，处理时间20-28h，观察细胞状态：若细胞状态好，则以含当前浓度药物的培养基筛选1周，随后继续增加药物浓度；若细胞状态不好，则更换无药物培养基培养24h-48h，随后继续加入药物，如此反复直至细胞在此药物浓度下正常生长；