[发明专利]一种表达人血清白蛋白的基因工程菌及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种表达人血清白蛋白的基因工程菌，其是在巴斯德毕赤氏酵母菌(Pichia pastoris)中整合有人血清白蛋白基因的表达载体的工程菌，所述的表达载体依次含有启动子、α引导肽、人血清白蛋白基因和终止子；所述的基因工程菌具有抗遗传霉素性能。利用该基因工程菌进行人血清白蛋白的表达时，甲醇诱导96小时后蛋白的产量即可达8.86g/L，生产效率可达92.29mg/L/h；且发酵过程中可无需通入无菌氧气。因此，本发明中的菌株生产效率明显更高，能大幅度缩短生产周期，降低时间及人员和设备运作成本，产业化意义较大。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种表达人血清白蛋白的基因工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

人血清白蛋白(HSA)是人体血浆中最丰富的蛋白质，含量占血清总蛋白的60％，约为35-40g/L，主要功能为维持血浆渗透压以及各类物质的转运。HSA广泛应用于休克及烧伤治疗、术后恢复、药物载体、细胞培养基等，其全世界需求量已达600吨/年左右，中国需求量约占其三分之一。目前，人血清白蛋白主要来自人血提取，相应的纯化工艺为低温乙醇沉淀法，其来源严重受到血液供给的限制，存在血液病毒传播和扩散风险，且纯化过程中对大量有机试剂和低温控制的需求也导致其效率低下。

利用转基因技术构建工程菌并生产外源蛋白最早起源于上世纪70年代，此后，包括大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、昆虫、动植物细胞以及动植物等在内的一系列外源蛋白表达系统得以建立和飞速发展，为珍贵的蛋白类药物以及更高效、更环保的工业酶的产业化应用提供了巨大的推动作用。目前，利用转基因技术已在多种表达系统中实现了人血清白蛋白的外源表达及相关纯化工作，包括大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、动植物细胞以及动植物。

大肠杆菌(Escherichia coli)是一种原核生物，因具有清晰的遗传背景、简单的营养要求以及安全性被广泛应用于外源蛋白的表达。早在1981年Richard等就利用大肠杆菌成功表达HSA，但仅定性检测出其表达，而产量未知；D.Sleep等于1990年利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)成功表达出HSA，但由于酿酒酵母表达系统产量较低，同时此系统会对HSA实施高度糖基化，极易引起免疫原性；武汉大学研究人员Yang He等将转基因技术应用于传统农作物水稻，实现了每公斤水稻获取2.75g高纯度HSA的喜人成绩。然而转基因植物的培养周期较长，受环境因素影响大，且易造成转基因作物的抗性基因扩散；台湾学者Yu-Kuo Liu等利用转基因植物离体细胞表达系统，实现了75mg/L 的HSA表达。但总体而言，转基因动植物细胞表达系统的产量不乐观，且培养成本较高，故一般不作为HSA产业化生产的首选。