[发明专利]利用DART-MS法快速测定尿液中3-羟基-3-甲基戊二酸的方法

说明书

本发明提供了一种利用DART‑MS法快速测定尿液中3‑羟基‑3‑甲基戊二酸含量的方法，本发明测定方法无需冗长的色谱分离，分析速度为秒级，能够有效的节省实验时间，具有简单、快速、高效的特点，该检测技术可以推广到尿液中小分子有机酸的测定领域，实际应用价值高，意义深远。

(一)技术领域

本发明涉及一种快速测定尿液中3-羟基-3-甲基戊二酸的方法，具体涉及一种利用DART-MS法(实时直接分析-质谱法)快速测定尿液中3-羟基-3-甲基戊二酸的方法。

(二)背景技术

3-羟基-3-甲基戊二酸尿症于1976年由Faul等首次报道，该病的临床表现为低血糖、代谢性酸中毒，以及尿液中可检出3-羟基-3-甲基戊二酸，由于3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A lyase，HMGCL)基因突变引起HMGCL活性缺陷，导致3-羟基-3-甲基戊二酸在体内蓄积。该病严重影响亮氨酸在体内的正常代谢，以及酮体的生成过程。酮体包括乙酰乙酸、3-羟基丁酸等，是机体发生低血糖时脑、心脏、肝脏等重要脏器的能量来源。3-羟基-3-甲基戊二酸尿症是因酮体代谢障碍导致不同程度的脑、心脏、肝脏等脏器损害。患者通常在新生儿期至婴幼儿期发病，国外报道死亡率达20％。但3-羟基-3-甲基戊二酸尿症同时也属于少数可以治疗的遗传病之一，如果确诊及时，患儿可以通过补充左旋肉碱来促进毒性有机酸代谢产物排出，以达到治疗的效果。文献报道的健康人3-羟基-3-甲基戊二酸水平约为0-9mg/L，即可以认为尿液中3-羟基-3-甲基戊二酸浓度低于9mg/L为阴性。

目前针对3-羟基-3-甲基戊二酸的检测最通用的方法是离线衍生化-气相色谱-质谱/质谱法，但这个方法存在前处理复杂，检测耗时长等缺点，该方法是医院现行的通用方法，国内外文献报道多为探究病理病因以及相关临床表现诊断，在方法学的开发上较少。而本发明中用的DART-MS法无需冗长的色谱分离，其分析速度为秒级，能够有效的节省实验时间。

实时直接分析技术(Direct Analysis in Real Time，DART)是一种新型的敞开式非表面接触型解析/离子化分析技术，于2002年被美国军方首次应用于化学战剂的测试，并于2005年首次进行文献报道，同年申请专利且商品化的DART面世。该方法将样品放置于DART离子源气体出口和质谱的采样锥口间，在大气压下，气体(如氮气、氦气或氩气)经放电产生的激发态原子瞬间解析并离子化样品表面的化合物分子，直接进入质谱分析。样品可以是气态、液态、固态，或任何几何形状，无需耗时的前处理和冗长的色谱分离，并实现定性定量，在样品的高通量筛选和检测方面正发挥越来越大的优势。

(三)发明内容

本发明提供了一种利用DART-MS法快速测定尿液中3-羟基-3-甲基戊二酸含量的方法。

本发明的技术方案如下：

一种利用DART-MS法快速测定尿液中3-羟基-3-甲基戊二酸含量的方法，所述方法为：

(1)绘制标准曲线

称取3-羟基-3-甲基戊二酸标准品，用超纯水配制成浓度范围在0.05～5mg/L梯度浓度的标准溶液，将所得标准溶液进行前处理，之后进样进行DART-MS法测定，得到标准溶液质谱图，以3-羟基-3甲基戊二酸m/z 161的特征峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，进而计算得到标准曲线方程；

所述标准溶液的前处理方法为：将所述标准溶液与乙腈等体积混匀，离心(3000rpm，10min)，弃去沉淀，用浓盐酸(36～38wt％)调节pH至1.0，加入乙酸乙酯(乙酸乙酯用量为标准溶液体积的3倍)混匀，离心(3000rpm，5min)，取上清液，残余物质重复进行加入乙酸乙酯混匀、离心、取上清液的操作步骤，重复两次，合并每次所得上清液，氮吹吹干，用甲醇/水(体积比1：1，甲醇/水用量为标准溶液体积的5％)复溶，即完成前处理；

所述DART-MS法的测定条件为：