[发明专利]一种制备具有确定15N丰度的N2O及基于15N同位素示踪法测量氮循环的方法

说明书

本发明涉及一种利用微紫青霉菌制备具有确定¹⁵N丰度的N₂O及基于¹⁵N同位素示踪法测量氮循环的方法，属于生物技术领域。本发明中的微紫青霉菌已于2017年8月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号为CGMCCNo.14146，具有确定¹⁵N丰度的N₂O的制备方法包括如下步骤：采集土壤样品，稀释后进行菌株的培养、测气筛选和鉴定；使用具有确定¹⁵N丰度的NaNO₃配置察氏液体培养基，并接种微紫青霉菌菌株，振荡培养后收集产生的N₂O，加入碱液吸收除去其中的CO₂，即得到具有确定¹⁵N丰度的N₂O。本发明的方法产气快速、准确，且操作简便、成本低；制得的气体作为标准气体用于氮素循环的研究，结果准确度和精确度高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种利用微紫青霉菌制备具有确定¹⁵N丰度的N₂O及基于¹⁵N同位素示踪法测量氮循环的方法。

背景技术

¹⁵N同位素示踪技术是我们开展氮素循环的研究最有效方法，它能区分氮素各周转过程(矿化、硝化、反硝化等)的速率和通量。目前对于¹⁵NO₃^--N和¹⁵NO₂^--N的检测，是通过添加化学试剂(如盐酸羟胺)，将硝态氮和亚硝态氮还原成¹⁵N₂O气体进行测定。在此方法中，需要用标准的¹⁵N₂O气体进行校准。而目前¹⁵N₂O的制备方法主要是将以¹⁵N标记的亚硝酸盐为原料通过化学还原反应生成。但是此方法存在较大问题：一是亚硝酸盐不稳定，储存过程中极易被氧化成硝酸盐，影响¹⁵N₂O的含量及丰度；二是产生的¹⁵N₂O气体不易保存，只能现配现用。

通过微生物的反硝化作用也可以产生N₂O，长期以来，人类一直认为只有细菌才能进行反硝化反应，细菌反硝化作用的产物主要是N₂，然而在1972年，人类首次发现担子菌门和子囊菌门中也存在反硝化活性，还发现一些以前被认为严格好氧的尖孢镰刀菌等多种真菌也能进行反硝化作用。真菌是一种真核生物，与细菌相比具有更为复杂的结构，是土壤氮循环过程中的重要参与者之一。相比细菌的反硝化作用，这些真菌的独特之处就在于真菌中存在P450(细胞色素P450，一氧化氮还原酶)，可利用NADH(还原性辅酶I)或NADPH(还原性辅酶II)作为直接电子供体将NO还原为N₂O。目前关于真菌反硝化作用的研究多集中于真菌对土壤N₂O释放的贡献，还未见有利用真菌生产制备具有确定丰度的¹⁵N₂O的研究。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，提出了一种利用微紫青霉菌，通过添加具有确定¹⁵N丰度的NaNO₃为底物，从而快速、准确的制备具有确定¹⁵N丰度的N₂O气体，操作简便，成本经济。

本发明的目的可通过下列技术方案来实现：

一种微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)菌株，已于2017年8月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号为CGMCC No.14146(保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，电话：010-64807355，电子邮件：cgmcc@sun.im.ac.cn)。