[发明专利]一种降解聚苯乙烯菌种的分离筛选及其鉴定方法

说明书

本发明公开了一种降解聚苯乙烯菌种的分离筛选及其鉴定方法，该菌种定名为：黑曲霉(Aspergillus niger)，已于2017年10月31日提交中国普通微生物保藏中心保存，保藏编号为CGMCC No.14629。该菌种采用黄粉虫为菌株来源体，先对选取的黄粉虫进行喂食聚苯乙烯，然后提取黄粉虫肠道微生物，采用多种培养基富集培养的方式进行菌种的分离筛选，并对筛选出的菌种采用自展法进行检测，采用Neighbor‑Joining法构建邻接树，根据系统发育树中组群关系对菌株进行分类，并结合菌株的形态观察结果确定菌株的分类地位，鉴定结果显示黄粉虫肠道中分离出的KHJ‑1菌株为黑曲霉Aspergillus niger，具有较好的降解聚苯乙烯的作用。

本发明生物材料样品保藏单位名称为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰路1号院3号，保藏日期为：2017年10月31号，保藏编号为：CGMCC No.14629，分类命名为：黑曲霉Aspergillus niger。

技术领域

本发明属于菌种分离鉴定技术领域，具体涉及一种降解聚苯乙烯菌种的分离筛选及其鉴定方法。

背景技术

石油基塑料的环境污染是世界性难题，据统计，2015年全球消耗塑料年产量3亿吨，其中应用最广的热塑性聚苯乙烯塑料占7.1％。聚苯乙烯塑料相对分子质量较高、耐腐蚀性好、稳定性甚强，普遍认为微生物无法降解。传统处理废旧塑料的焚烧法、掩埋法均不能从根本上解决污染问题，再加工受到加工次数的限制且应用范围较窄，为减缓塑料累积速度而研发的生物可降解塑料，并不能清除已形成的塑料垃圾。通常高聚物的降解如光氧化、臭氧诱发、催化降解及生物降解等，其中生物降解是由生长在聚合物表面或内部的微生物引起，能耗低且不会造成二次污染，因此生物法降解是绿色环保的降解方式。

黄粉虫俗称面包虫，为全变态类昆虫，研究表明黄粉虫幼虫可富集重金属与微量元素于体内，并逐渐适应重金属污染的环境，有科学报道中学生陈重光的科研实践中发现黄粉虫幼虫可消化与吸收塑料；沈叶红等从黄粉虫肠道中分离出8株细菌，并对黄粉虫降解塑料的机理进行了初步探究；杨军等发现以聚苯乙烯泡沫塑料为单一食源喂养黄粉虫幼虫，100只幼虫每天可以吃掉34-39mg的泡沫塑料；陈冠舟等以高通量测序法探究啮食聚苯乙烯泡沫塑料黄粉虫肠道菌群结构，揭示了肠道细菌具多样性，并且肠道细菌可能在黄粉虫生物降解塑料的过程中起主导作用。由于昆虫肠道菌可分泌帮助昆虫肠道消化的酶，具有非常丰富的物种多样性及代谢途径多样性，因此从昆虫中分离降解菌是开发高分子材料生物降解的重要途径之一。

发明内容

根据以上现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提出一种从昆虫中分离降解聚苯乙烯菌种，并对菌种进行鉴定。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种降解聚苯乙烯菌种的分离筛选，具体包括如下步骤：

1)选取体态均匀的黄粉幼虫，进行60天的聚苯乙烯白色泡沫塑料喂养，收集黄粉幼虫；

2)黄粉虫肠道微生物的分离纯化：将上述收集的黄粉幼虫依次经酒精消毒、SAB缓冲液漂洗及无菌水清洗后，解剖取出肠道，加入无菌氯化钠溶液，无菌研磨至无可见颗粒，然后向研磨物中加入无菌氯化钠溶液进行梯度稀释，将稀释液涂布于CA培养基、CYA培养基与MEA培养基，30℃恒温培养，待菌株长出后，挑取菌株边缘菌丝进行培养，反复直至纯化后转接试管中保存。

优选的，所述酒精消毒的酒精浓度为75％，消毒时间为1min。

优选的，所述SAB缓冲液为100ml浓度为1.5％的醋酸溶液和200ml物质量浓度2.72％醋酸钠溶液的混合液，pH为5.6。