[发明专利]一种甘露聚糖酶高产菌株及其应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体内容涉及一株高产酸性甘露聚糖酶的毕赤酵母突变菌株及其应用。所述毕赤酵母突变菌株，其保藏编号为CCTCC NO:M2017749。所述突变菌发酵上清液中甘露聚糖酶酶活最高达到约1760U/mL，比出发菌提高了93.2％；高密度发酵168h后，突变菌发酵上清液中甘露聚糖酶酶活达到20175U/mL，较出发菌株提高了72.7％，取得了意料不到的效果。所述突变菌株可广泛应用于甘露聚糖酶的生产，有利于降低该酶的生产成本，市场前景广阔。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体内容涉及一株高产酸性甘露聚糖酶的毕赤酵母突变菌株及其应用。

技术背景

甘露聚糖是半纤维素家族的重要成分之一，分为以下四个亚类：直链甘露聚糖，葡甘露聚糖，半乳甘露聚糖，半乳葡甘露聚糖。它们由甘露糖或甘露糖与葡萄糖组合以β-1，4-糖苷键形成骨架，另外半乳糖会以α-1，6-糖苷键连接于骨架上作为侧链。甘露聚糖是软木中半纤维素成分的主要组分，并广泛分布于植物组织中，如角豆胶，魔芋和瓜尔豆胶等。

β-甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)是水解β-1，4-D-吡喃甘露糖为主链的内切水解酶，作用底物主要是甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、以及半乳葡甘露聚糖。β-甘露聚糖酶主要属于糖苷水解酶类第5和26家族，少部分属于第113家族，其中第5家族又分为8个亚类，β-甘露聚糖酶属于第7和8亚类，分别来源于真核生物和细菌，这两个亚类成员之间的序列相似性低于20％。

随着β-甘露聚糖酶的深入硏究，其应用领域也在不断的扩展，并拥有一个广泛的工业酶应用市场，包括食品和饲料，咖啡萃取，生物乙醇生产，杀粘菌剂，制药，纺织，洗涤，造纸，石油，天然气工业，及生物技术等领域。在食品和医疗领域，作为甘露聚糖丰富来源的魔芋粉、角豆胶和瓜尔豆胶等被甘露聚糖酶降解为甘露寡糖后，能够代替蔗糖作为食品添加剂，降低血糖，维持胆固醇平衡，増加肠道益生菌，并促进其生长和繁殖。动物的植物性饲料中添加甘露聚糖酶能破坏细胞壁释放密封的能增高肠壁绒毛的营养物质，水解饲料中甘露聚糖等抗营养因子，降低饲料粘度，从而达到改善饲料吸收率的目的。在纸浆漂白的过程中需要除去木质素，使用甘露聚糖酶不仅能去除该杂质，同时又减少污染。软木是纸浆的主要来源，含有15～20％主要成分为半乳甘露聚糖的半纤维素。这就使得具有该成分特异性的甘露聚糖酶成为软木纸浆漂白的最佳选择。树胶中的甘露聚糖通常被用作冰激凌、调味酱、发胶、护发素等的増稠剂，而甘露聚糖倾向于吸附衣物纤维，因此很难去除含有甘露聚糖的污渍，采用含有耐碱甘露聚糖酶的洗涤剂则可以将其水解为易溶的小分子，使衣物等易漂洗。在石油和天然气工业中，甘露聚糖酶作为钻探过程中的优质生物破胶剂，具有成本低，破坏小，效率高等优点。甘露聚糖酶是天然多糖结构分析和植物细胞破壁的良妤工具酶，生成具有增殖双歧杆菌生理功效的低聚糖。

不同微生物所产的甘露聚糖酶在分子量、最适催化温度、最适pH、底物特异性等方面都存在很大差异。真菌产甘露聚糖酶作用偏酸性，而细菌和放线菌产甘露聚糖酶作用的pH近中性或偏碱性，但稳定性较好。目前甘露聚糖酶的生产主要采用细菌或芽孢杄菌的液体发酵法，主要缺点是需要底物诱导，且发酵工艺复杂，成本高，产率低，酶活性低且所产中性酶不适于酸性作用环境。而在饲料中应用的甘露聚糖酶，需要在酸性条件下具有高活性，因此酸性β-甘露聚糖酶的研究与开发在饲料工业应用中具有重要意义。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种高产酸性甘露聚糖酶的毕赤酵母突变菌株及其应用。申请人通过紫外诱变的方法筛选获得一株毕赤酵母突变菌株，能大幅度提高酸性甘露聚糖酶的表达量，可广泛应用于该酶的生产。

本发明提供了一株突变菌毕赤酵母P-M241(Pichia pastoris P-M241)工程菌，已于2017年11月30日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017749。

所述的毕赤酵母工程菌，其携带有表达甘露聚糖酶基因的重组载体。