[发明专利]一种黑曲霉种子培养及其制备柠檬酸的方法

说明书

本发明公开了一种黑曲霉种子培养及其制备柠檬酸的方法，所述方法包括如下步骤：(1)取培养成熟的黑曲霉麸曲孢子，得到分散孢子悬液；(2)培养步骤(1)中的分散孢子悬液，得到发芽孢子；(3)发芽孢子重新分散，种子罐内培养，得到成熟种子液；(5)成熟种子液转至发酵罐内培养发酵，得到柠檬酸发酵液。本发明解决了孢子萌发过程中聚集的问题，提高孢子成球率，增加菌丝球数量，有效控制菌丝球的大小均一性，提高菌体的转化效率，发酵转化率提高，发酵周期缩短。

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其是涉及一种利用特殊培养的黑曲霉种子液制备柠檬酸的方法。

背景技术

柠檬酸是一种重要的有机酸，又名枸橼酸，无色无臭，有很强的酸味，易溶于水，在工业，食品业，化妆业等具有极广泛的用途。目前，柠檬酸主要通过发酵法生产获得，以玉米等淀粉质农作物作为原料。

传统柠檬酸发酵通常是先进行黑曲霉孢子扩培，得到成熟的孢子；然后孢子接入种子培养基中获得成熟的种子液；最后将种子液移入发酵培养基中发酵得到柠檬酸发酵液。

传统种子培养通常需要24-32h，培养周期较长。而在种子培养过程中，前期0-8h主要是黑曲霉孢子吸水膨胀，孢子萌发，恢复代谢活动的过程，8h后才进入菌丝生长的阶段。前期孢子吸水膨胀到萌发，几乎不消耗营养物质，只需要少量营养物质促进其恢复代谢活力；另外几乎不消耗溶解氧，对搅拌、转速、风量要求低；而菌丝生长阶段则需要消耗大量的营养物质和溶氧，并且pH会逐渐下降至2.0以下。传统种子培养过程中，孢子萌发和菌丝生长均在种子罐内，种子罐培养时间增加1/3，降低种子罐利用率，增加前期能耗。

另外，由于孢子间存在电荷吸附作用，分散的孢子容易重新聚集成团，结团后多个孢子只能形成一个菌丝球，导致孢子形成菌丝球的比例降低，传统种子培养过程中孢子成球率只有60％；而且菌丝球大小不均一，部分菌丝球直径偏大，中心形成致密区，无法与营养物质和氧气有效接触，导致菌体转化效率降低。

因此，如何改进黑曲霉种子培养方法，缩短种子培养时间，提高种子罐利用率；以及提高孢子成球率，和控制菌丝球均一性是柠檬酸发酵生产中亟待解决的一个重要问题。

发明内容

针对传统技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种黑曲霉种子培养及其制备柠檬酸的方法。本发明方法将黑曲霉孢子萌发与菌丝体生长两阶段分开培养，孢子萌发在小容器中进行，孢子萌发后转接至种子罐内进行菌丝生长，缩短种子培养时间，提高种子罐利用率。本发明解决了孢子萌发过程中聚集的问题，提高孢子成球率，增加菌丝球数量，有效控制菌丝球的大小均一性，提高菌体的转化效率，发酵转化率提高，发酵周期缩短。

本发明的技术方案如下：

一种黑曲霉种子培养及其制备柠檬酸的方法，包括如下步骤：

(1)取培养成熟的黑曲霉麸曲孢子，加入5～10倍体积的无菌水，震荡浸泡0.5～12h，用四层纱布过滤，得到分散孢子悬液；

(2)将步骤(1)中的分散孢子悬液接入稀糖液中，在温度为30～42℃，pH为3.5～6.0，搅拌转速为0～100rpm的条件下，培养4～10h，得到发芽孢子；所述稀糖液中含有麸皮或淀粉渣颗粒物质，使得固形物含量为10～100g/L，另外，稀糖液中添加体积百分比为0.05～0.1％的吐温80；

(3)培养结束后，将搅拌转速提高至200～1000rpm，搅拌0.5～2h，将聚集的发芽孢子重新分散；

(4)将步骤(3)中分散的发芽孢子，转接至种子罐内，在温度为35～39℃，风量为0.2～0.6vvm，罐压为0.05～0.1Mpa，搅拌转速为100～200rpm的条件下，培养10～16h，得到成熟种子液；

(5)将步骤(4)中成熟种子液转至发酵罐内培养，还原糖低于5g/L停止发酵，得到柠檬酸发酵液。