[发明专利]一种线性多泛素基因的连接方法

权利要求书

1.一种线性多泛素基因的连接方法，包括以下步骤；

1）设计优化单泛素基因序列；

根据泛素的氨基酸序列与大肠杆菌密码子偏好性，设计优化单泛素基因序列的密码子频率、GC含量、mRNA二级结构、重复序列、酶切位点性质，并去除终止密码子；

设计单泛素基因的3’端末位三个碱基为GGC，作为stu I识别位点的前三个碱基，在此序列的3’端添加stu I识别位点的后三个碱基 CTA，即为stu I的识别位点，并于此位点后添加一段编码柔性氨基酸的碱基序列和Hind III酶切位点以便于后续的连接以及蛋白纯化；

2）优化的单泛素基因连接单位的获取：

以优化单泛素基因序列为模板设计引物，利用设计的引物运用PCR的方法扩增出所需的单泛素基因连接单位Ub-linker与c-Ub-linker；

3）单泛素基因连接单位与原核表达载体的初步连接；

PET22b原核表达载体、Ub-linker进行双酶切NdeⅠ、Hind Ⅲ后，利用T4 DNA连接酶进行连接，获得连接成功的线性单泛素基因；

4）线性多泛素与原核表达质粒的连接方法：

将c-Ub-linker、线性单泛素基因进行双酶切stuⅠ、Hind Ⅲ后，利用T4 DNA连接酶进行连接，获得连接成功的线性泛素基因；

获得的线性双泛素基因的脱氧核糖核苷酸序列如下所示：SEQ no.2。

2.如权利要求1所述的一种线性多泛素基因的连接方法，其特征在于：

获得的线性三泛素基因的脱氧核糖核苷酸序列如下所示：SEQ no.3。

3.如权利要求1所述的一种线性多泛素基因的连接方法，其特征在于：

获得的线性四泛素基因的脱氧核糖核苷酸序列如下所示：SEQ no.4。