[发明专利]一种基于双分子荧光互补技术的NGAL检测试剂盒、制备及使用方法

说明书

本发明提供了一种基于双分子荧光互补技术的NGAL诊断试剂盒。所述试剂盒包括：抗NGAL抗体偶联的荧光蛋白N端片段、抗NGAL抗体偶联的荧光蛋白C端片段；本发明还公开了所述一种基于双分子荧光互补技术的NGAL诊断试剂盒的制备方法，该方法包括：抗NGAL抗体偶联的荧光蛋白N端片段的制备、抗NGAL抗体偶联的荧光蛋白C端片段的制备；最后还公开了该试剂盒的使用方法；本发明试剂盒具有检测快速、特异性好、操作方面、免清洗、精密度好等优点，便于临床检测使用，其应用于急性肾损伤的监测，可以提高急性肾损伤诊断的准确率，具有极大的市场价值。

技术领域

本发明涉及一种双分子荧光互补技术用于体外免疫诊断检测人体内NGAL的含量，属于疾病诊断检测领域。

背景技术

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)临床常见而严重，在美国，社区获得的AKI占总住院患者的1％，住院患者的AKI发生率0.15％～7.5％之间，远高于社区，而ICU病房的 AKI发生率高达5％～20％。我国没有大宗的流行病学调查，但各地报道的发生率均较高，例如北京大学医院报道冠状动脉搭桥术后的病人AKI发生率为27.94％。尽管临床治疗水平不断提高，但是AKI的发病率还在增长，其病死率也居高不下。目前应用最多的AKI定义是ADQI (acute dialysis qualith initiative，ADQI)组织于2002年制定的：肾功能在48h内急剧下降，表现为血清肌酐(serum creatinine，Scr)上升＞0.3mg/dl(26.4μmol/L)或Scr上升＞50％(达到基线的1.5倍)或尿量减少(＜0.5ml·kg-1·d-1)超过6h，并将AKI分为5级(RIFLE分级)。可见Scr仍然是经典的诊断AKI的指标，但Scr常受一些非肾脏因素影响，其数值变化常晚于早期肾损伤，不能准确、敏感地反映肾功能情况，使得一些可以恢复的AKI贻误了最佳治疗时机。因此，近年来众多的研究致力于寻找稳定敏感、能早于Scr和尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)反应肾功能的具有诊断价值的生物标志物，希望对AKI进行早期干预，降低病死率。

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associatedlipocalin，NGAL) 是一种相对分子质量25×10³的小分子分泌型蛋白。经鉴定，这种相对分子质量为25×10³的蛋白质由198个氨基酸组成，前20个氨基酸为前导序列，易自身聚合形成相对分子质量为46×10³的同源二聚体，也可以与基质金属蛋白酶9(matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)形成相对分子质量为135×10³的异源二聚体。

NGAL是一种小分子蛋白，可以直接检测尿液，样本的获取比较简便。在有关急性肾损伤的动物模型中，小鼠在被诱导肾脏受损后一个小时后，检测排出的尿液NGAL浓度水平，发现受诱导的小鼠的NGAL的浓度显著高于正常小时，而且即使是轻微的“亚临床”型肾缺血， NGAL也可检测到其浓度的变化。NGAL不仅存在于尿液中，也存在于血浆中。血浆中NGAL浓度的测定AKI的早期诊断将更加有利，因为它能避免因少尿带来的麻烦，也能减轻因治疗而使用利尿药等带来的干扰。急性肾功能损伤过程中NGAL水平偏高，预后将发展成为急性肾功能衰竭，急性肾功能衰竭(ARF)是心脏手术、肾毒性、肾移植常见的并发症。NGAL 在以下情况下可作为早期监测AKI的指标：儿童和成人心肺搭桥手术，冠心病介入治疗(PCI)，在急诊科或加护病房的重症患者(心脏衰竭，败血症，多器官功能衰竭)，肾移植，慢性肾病患者。NGAL在造影剂对肾损伤方面的检测也得到研究者的证实，在小儿心导管插入手术后，部分患者2h后就能在血液和尿液中检测到有NGAL升高，与之后2-3天血肌酐的升高密切相关。在成人患者中，造影后4h可以在患者尿液中检测到有NGAL异常升高，而在血液中2h就可发现NGAL异常升高。