[发明专利]一种基于双分子荧光互补技术的RBP检测试剂盒、制备及使用方法

说明书

本发明提供了一种基于双分子荧光互补技术的RBP诊断试剂盒。所述试剂盒包括：抗RBP抗体偶联的荧光蛋白N端片段、抗RBP抗体偶联的荧光蛋白C端片段；本发明还公开了所述一种基于双分子荧光互补技术的RBP诊断试剂盒的制备方法，该方法包括：抗RBP抗体偶联的荧光蛋白N端片段的制备、抗RBP抗体偶联的荧光蛋白C端片段的制备；最后还公开了该试剂盒的使用方法；本发明试剂盒具有操作简单、线性范围宽、特异性好、免清洗、准确度高等优点，便于临床检测使用，将其应用于肾脏疾病的监测，可以及时反映肾脏疾病症状，准确反应病情变化，则就会受到市场的广泛欢迎和具有极大的市场价值。

技术领域

本发明涉及一种双分子荧光互补技术用于体外免疫诊断检测人体内RBP的含量，属于疾病诊断检测领域。

背景技术

视黄醇结合蛋白(Retinol binding protei，RBP)是一种低分子量的亲脂载体蛋白，属 Lipocalin蛋白超家族成员。其功能是从肝脏转运维生素A至上皮组织，并能特异性地与视网膜上皮细胞结合为视网提供维生素A。RBP广泛存在于人体血液、尿液及其他体液中，由于其具有分子量小和半衰期短的特点，在肝脏、肾脏疾病的早期诊断和疗效观察中有重要临床意义，又因RBP可特异地反映机体的营养状态，因此也是一项诊断早期营养不良的敏感指标。

血清中90％的RBP与视黄醇结合形成复合物当RBP与靶细胞表面的受体结合时复合物解离，游离的RBP由肾小球滤出，大部分由近端小管上皮细胞重吸收，并被分解成氨基酸，供体内合成利用。急性肾功能衰竭或透析治疗时，体内RBP会发生一定的改变。急性肾功能衰竭时RBP患者血清RBP明显升高，可能与RBP的结构变化有关。RBP在体内有多种形式，分别为多肽链C末端失去1个残基的RBP1和失去2个残基的RBP2。正常人体内多为RBP1，而RBP2在体内一旦形成，即通过肾脏排出体外。当肾功能衰竭时，无法及时清除体内的RBP2，从而导致体内的RBP含量升高。85％的RBP与AP结合，形成复合物，不能被肾小球滤过，而剩下的15％可自由通过肾小球，正常情况下被肾小管重吸收。当肾脏疾患或感染等导致肾小管重吸收功能障碍时，尿中RBP浓度升高，血清RBP浓度下降。因此尿中RBP测定是诊断早期肾功能损伤和疗效判定的敏感指标。

RBP的测定方法很多，包括单向免疫扩散法、酶免疫测定法、时间分辨荧光免疫法、放射免疫法、乳胶颗粒增强免疫比浊法等。其中单向免疫扩散法一般用于定性检测；酶免疫测定法操作时间长，且较繁琐，对实验员的要求较高；基于免疫层析的时间分辨荧光免疫法虽然灵敏度较高，但是CV较大，目前尚无解决的可行办法；放射免疫法因为放射污染，逐渐被淘汰；目前较多采用的颗粒增强免疫比浊法，技术已趋于成熟，操作简便，干扰因素少，但液态的胶乳试剂稳定性不佳，检测结果精准性不佳。

为解决上述问题，如果能利用RBP的抗体，以双分子荧光互补技术为平台，研发出一种针对肾脏疾病诊断的RBP快速检测试剂。使其与现有检测试剂相比，具有操作方便、检测快速、灵敏度高、准确性好等优点；将其应用于肾脏疾病的监测，可以及时反映肾脏疾病症状，准确反应病情变化，则就会受到市场的广泛欢迎和具有极大的市场价值。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种可用于定量检测RBP的检测试剂盒、其制备及使用方法。

本发明通过以下技术方案实现：

一种制备基于双分子荧光互补技术RBP检测试剂盒的方法，包括如下步骤：

1)抗RBP体偶联荧光蛋白N端片段；

2)抗RBP抗体偶联荧光蛋白C端片段；

在上述技术方案中，所述抗RBP抗体为针对RBP不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。

在上述方案中，所述抗RBP抗体偶联荧光蛋白N端片段的步骤中，荧光蛋白N端片段与抗RBP抗体的质量比为1∶1-10。