[发明专利]一种相对定量分析肉鸡热休克蛋白HSPA5的方法

说明书

本发明公开了一种相对定量分析肉鸡热休克蛋白HSPA5的方法，先进行肉鸡热休克蛋白HSPA5的提取，再对肉鸡热休克蛋白HSPA5进行酶切获得特异性肽段，然后使用液质联用仪检测特异性肽段的子母离子对，获得特异性肽段的子离子信号强度总和，根据特异肽段的子离子信号强度总和获得肉鸡热休克蛋白HSPA5的信号强度，通过比较不同处理肉鸡样品中肉鸡热休克蛋白HSPA5的信号强度，从而实现对不同处理肉鸡样品中肉鸡热休克蛋白HSPA5的相对定量；所述肉鸡热休克蛋白HSPA5的特异性肽段为3条，3条特异性肽段的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。本发明的相对定量方法相对于基于抗体Western Blot法特异性更强，并且免去了制备抗体的繁琐步骤，提高了鸡源HSPA5蛋白检测通量和效率。

技术领域

本发明涉及食品检测技术领域，特别是指一种相对定量分析肉鸡热休克蛋白HSPA5的方法。

背景技术

在全球环境变暖和集约化养殖条件下，肉鸡的养殖密度逐渐变大，热应激已成为肉鸡养殖过程中普遍面临的问题。热应激是动物生长过程中常见的一种体外应激，当动物的生长环境温度超过其代谢稳定区上限，通过机体物理调节不能维持热平衡时，导致机体会产生应对环境高温所产生的非特异性应答反应。热应激会造成肉鸡采食量下降、生长速度慢、体增重降低、饲料转化率低。据报道，慢性热应激显著降低肉鸡采食量(-16.4％)、体增重(-32.6％)和提高了料重比(+25.6％)。同时，热应激还影响消化代谢，降低肉品质，严重的会造成肉鸡免疫力下降，导致死亡率升高，给肉鸡生产带了巨大经济损失。据报道，美国每年因热应激造成畜牧生产损失约16.9-23.6亿美元，其中家禽生产损失达1.25-1.65亿美元，肉鸡损失约5200万美元。相比美国，我国也是肉鸡养殖大国，生产与消费均位居世界第二，但行业集团化、产业化程度不足，养殖环境控制能力弱，热应激对我国肉鸡生产造成的损失更为严重。

在热应激条件下，动物会产生一组热休克蛋白(Heat Shock Proteins,HSPs)，这一现象称热休克应答。HSPs是一组分子量不等的酸性蛋白(等电点5.10～ 6.15)，目前按相对分子量以及同源程度可分为HSP90、HSP70、小分子HSP 和泛素4个家族。HSP70家族是一类最保守和最重要的热应激蛋白家族，包括分子量为68、72、73、75、78KD等多种蛋白，它们具有相同的等电点和相似的胰蛋白酶肽谱。HSPA5是肉鸡体内非常重要的一类热休克蛋白，其在肉鸡体内表达含量的变化随着热应激水平的变化而变化，是反应热应激水平的重要生理指标。现在判断HSPA5在体内相对含量的分析方法主要是在mRNA水平、蛋白质水平进行比较，通过提取组织体内RNA后反转成cDNA，根据HSPA5 基因设计特异性引物对cDNA模板进行扩增，使用荧光实时定量PCR技术对模板中HSPA5转录水平进行比较分析。由于基因转录后，还需经历剪切和拼接等转录后调控才能表达成蛋白，因此基因在转录水平上表达量并不能真实反应其基因产物蛋白的表达量。目前，在蛋白水平上分析HSPA5最能反应出该蛋白在组织、细胞和体液中的表达含量，通常会采用酶联免疫法、Western Blot、组织原位杂交等方法，然而以上蛋白水平检测方法都需要高质量的抗体特异识别HSPA5蛋白。由于现在市场上的制备抗体的抗原蛋白多数来源于人、小鼠和大鼠等模式生物，针对鸡源HSPA5的抗体在市场上还未有出现，导致现在还没有能在蛋白水平上定量分析肉鸡HSPA5表达量的方法。若想建立在蛋白水平定量分析肉鸡HSPA5的方法，需要制备可特异识别肉鸡HSPA5的抗体。制备HSPA5单克隆抗体可以提高抗体的特异性，减少非特异结合和交叉反应，但是单克隆控体周期长、费用高；若制备HSPA5多克隆抗体可以减少费用，但是非特异性的交叉反应较为严重，成功率很低。

根据定量HSPA5蛋白的表达需求，综合考虑现有的分析方法，本发明使用多重离子检测的方法建立一种基于质谱技术的HSPA5蛋白定量方法，该方法不需要制备抗体，根据HSPA5特异性肽段序列设计子母离子对和碰撞能量，实现在蛋白质水平上对HSPA5蛋白进行相对定量分析，大大提高了检测灵敏度、准确性和检测通量。

发明内容