[发明专利]一种植物组织中马铃薯腐烂茎线虫的分离方法

说明书

本发明公开一种植物组织中马铃薯腐烂茎线虫的分离方法，将5ml 25％(W/V)Pluronic F‑127水溶液加到细胞培养板中，室温静置30min形成半固态凝胶；将发病薯块切成2‑4mm薄片，于培养板孔边缘浸入Pluronic凝胶中，静置2h，使茎线虫从植物组织中游出；用移液器沿培养板孔另一侧缓慢吸取含有茎线虫的Pluronic凝胶，装入2ml离心管，在4℃放置20min使凝胶溶解，后离心使线虫沉淀，弃上清，加入1ml灭菌水清洗茎线虫，离心、回收茎线虫，经3‑5次重复清洗、离心回收后即获得纯净的茎线虫悬浮液。该方法可显著提高茎线虫的分离效率及分离产物的纯净度，有效满足茎线虫病的研究工作需求。

技术领域

本发明涉及一种植物组织中寄生线虫的分离方法，具体涉及一种植物组织中马铃薯腐烂茎线虫的分离方法，属农业植物保护领域。

背景技术

马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructorThorne)是世界范围内重要的农业害虫，其寄主范围包括100多种重要经济作物及杂草。在中国腐烂茎线虫主要为害甘薯，通常可造成甘薯减产20-50％，甚至绝收。此外，该线虫还可为害马铃薯、花生、大蒜、胡萝卜、人参等重要经济作物，现已成为众多研究项目的焦点。

获取充足、纯净的实验材料是开展相关研究的基础。目前通用的腐烂茎线虫分离方法主要为漏斗法和浅盘法，操作方法可简单表述为将一个筛盘和一个盛水盘套放在一起，在筛盘上放一层滤纸或面巾纸，用水淋湿。将发病的植物组织切碎后放在滤纸上，向底部盛水盘中加水，淹没植物组织即可，室温下放置24h。由于腐烂茎线虫具有亲水性，浸泡分离期间线虫会从植物组织中游出，再由于自身的重力作用，游出的线虫会逐渐沉降到容器底部，此时收集容器底部的浸泡液即得到线虫悬浮液。

上述方法的不足之处在于，首先游出的线虫需主动穿过滤纸或面巾纸才能到达容器底部，大大降低了茎线虫回收效率。其次，长时间浸泡会导致滤纸或面巾纸破损，纸的残渣和植物组织都会混入线虫悬浮液，很难获得洁净的线虫。第三，为提高茎线虫对滤纸的通过率，就只能延长浸泡提取时间。然而长时间的浸水会导致发病植物组织内杂菌的快速繁殖，增加茎线虫的死亡率。此外，为得到较为干净的茎线虫，许多实验室利用镰刀菌培养茎线虫，然而该方法从开始培养到收集需要40-50d的时间，周期很长，且每个培养皿仅能收集到10000-40000头茎线虫，成本高，效率低。因此开发一种成本低、效率高、分离产物干净的马铃薯腐烂茎线虫分离方法，将对促进相关研究的开展具有十分重要意义。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种植物组织中马铃薯腐烂茎线虫的分离方法，能提供大量、干净的马铃薯腐烂茎线虫，满足茎线虫病的研究工作需求。

为了实现上述目的，本发明采用的一种植物组织中马铃薯腐烂茎线虫的分离方法，具体包括以下步骤：

1)称取一定量的Pluronic F-127放入烧杯中，按照Pluronic F-127浓度为25％的比例向烧杯中加入灭菌水，然后将烧杯在冰浴条件下搅拌过夜，待Pluronic F-127完全溶解，溶液澄清透明后放入4℃冰箱保存备用；

2)取灭菌的细胞培养板，向培养板的每个板孔中加入5ml Pluronic F-127溶液，室温静置30min使Pluronic F-127溶液形成半固态凝胶，得Pluronic胶；

3)将发病薯块切成2-4mm的薄片，用镊子夹取病薯片沿板孔一侧贴壁轻轻放入Pluronic胶中，室温下静置2h，使茎线虫从植物组织中游出；

4)用移液器沿板孔另一侧吸取含有茎线虫的Pluronic胶；

5)将吸取的含有茎线虫的Pluronic胶装入2ml离心管，在4℃冰箱中放置20min使Pluronic胶溶解，离心使茎线虫沉淀，弃去上层Pluronic胶溶液；