[发明专利]一种通路克隆入门载体的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速高效低成本构建通路克隆(Gateway)技术的入门载体的构建方法。

背景技术

载体构建是分子生物学和基因工程研究中必不可少的环节，是功能基因组研究的基本技术。随着分子技术的不断发展，目前已建立了多种载体构建方法，主要包括：传统的酶切连接法、重叠延伸PCR法、一步克隆法、In-Fusion试剂盒法、不依赖序列和连接的同源重组方法(Sequence and ligation-independent cloning，SLIC)和Gateway技术等。其中，Invitrogen公司开发的Gateway技术以λ噬菌体的位点特异重组系统为基础，首先利用BP反应(一个attBDNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应)或TOPO克隆将扩增的PCR片段构建至Gateway入门载体，再通过LR反应(一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应)将目的片段从入门载体克隆至不同功能的Gateway目的载体中，该方法具有以下优点：1)不受限制性内切酶酶切位点的限制；2)入门载体通用于不同目标载体；3)构建过程简单快速且定向插入，从而大大提高了实验效率。目前Invitrogen公司开发了多种可供选择的Gateway目的载体，同时研究人员也开发了很多与Gateway技术兼容的载体系统，如Mark等构建了与Gateway技术兼容的农杆菌双元表达载体pMDC系列载体，非常方便用于植物功能基因组研究，包括基因表达、蛋白亚细胞定位、蛋白互作、启动子表达分析等系列分子生物学试验。

目前构建入门载体有三种方法，一种方法是通过BP反应将PCR片段重组到pDONR和pENTR等系列载体，载体可以重复使用但是BP重组酶价格昂贵，而且插入片段长于2KB时效率会大大降低；第二种方法是利用TOPO克隆或TA克隆方法将PCR产物连接到pENTR/D-TOPO和pCR8/GW/TOPO等载体，但是这些入门载体价格昂贵，且不能够复制和反复使用，大大增加了实验成本；第三种方法是利用限制性内切酶将PCR片段连到入门载体，如Fu等构建的GEC和PEC载体，该方法成本低廉，但是常受限于载体上的酶切位点，而且耗时过长。因此开发一种快速高效低成本构建通路克隆入门载体的方法对于推广通路克隆应用有着重要意义。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中构建通路克隆入门载体存在的问题，提供一种通路克隆入门载体的构建方法，该方法省时，成本低，操作简单，成功率高，该方法构建的入门载体可以反复保存和反复使用，可兼容于具有attR序列的目标载体，用于功能基因组学和基因工程的研究和应用。

技术方案

一种通路克隆入门载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)引物设计

根据pCR8载体和水稻异分支酸合成酶基因的启动子(ICS1pro)序列设计基因扩增引物ICS1pro-F1和ICS1pro-R1，根据水稻异分支酸合成酶基因的启动子(ICS1pro)基因序列设计菌落PCR引物ICS1pro-F2和ICS1pro-R2；

(2)ICS1pro片段的扩增与纯化

以CTAB方法提取的日本晴的DNA为模板进行PCR基因扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并利用胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，即得ICS1pro片段；

(3)pCR8片段的获得

采用通路克隆入门载体pCR8-AtS5H作为原始载体，利用限制性内切酶EcoRI对其进行单酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并利用胶回收试剂盒对割胶产物进行回收，得到pCR8片段；

(4)pCR8-ICS1pro质粒的构建

利用SLIC法将回收的ICS1pro片段和pCR8片段进行连接，其中ICS1pro片段和pCR8片段的摩尔比为2:1，26℃金属浴孵育2.5min，然后立即置于冰中10min，取反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态(热激法)，采用菌落PCR验证和测序进行鉴定，从而最终得到阳性入门克隆载体pCR8-ICS1pro。

进一步，步骤(1)中，所述水稻采用日本晴。

进一步，步骤(1)中，所述基因扩增引物ICS1pro-F1：

5’-GCAGGCTCCGAATTCTGGCTTGGGTAGGATTATG-3’；

引物ICS1pro-R1：5’-AAGCTGGGTCGAATTCCGGGTGGGAGGAGGAAGAAG-3’；