[发明专利]烟草14‑3‑3g基因的植物表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及烟草14-3-3g基因植物表达载体及其在制备吸收甲醛能力增强的转基因植物中的应用。

背景技术

甲醛(Formaldehyde, HCHO)是对所有生物都具毒性的挥发性有机物，HCHO对人体有多方面的毒害作用且与人的许多疾病有一定相关性，它对皮肤、黏膜、肝脏、生殖系统以及神经系统等都表现出显著的毒害作用。外源性HCHO通过吸入或皮肤黏膜接触的方式进入人体，首先对皮肤和黏膜有一定刺激性和致敏性，空气中HCHO浓度超过0.6 mg/m³会对眼睛产生刺激作用，若浓度更高，则会引起皮肤红肿和疼痛。植物暴露于HCHO环境中会导致其体内产生过多的活性氧(Reactive oxygen species, ROS), 若ROS大量积累将对植物细胞内膜脂、蛋白质、DNA等重要的生物大分子产生氧化损伤，甚至使细胞膜的破裂，导致细胞胞液的外渗和细胞的相对电导率增大，ROS的积累还会使丙二醛(Malondialdehyde, MDA)和过氧化氢(Hydrogen peroxide，H₂O₂)含量上升，并加速叶绿体中叶绿素的分解。

14-3-3蛋白是真核生物细胞中一组高度保守的酸性二聚体蛋白质，在植物中，14-3-3蛋白已被证实广泛分布于细胞质、细胞核、线粒体基质、叶绿体基质和类囊体膜上。每个14-3-3蛋白亚基可以独立结合1个靶蛋白，或两个亚基同时与一个靶蛋白的两个结构域结合，在14-3-3蛋白的结合谱中，绝大多数与14-3-3蛋白结合的靶蛋白含有磷酸化的丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)位点，只有少数含有非磷酸化的识别序列。14-3-3蛋白是植物细胞内非常重要的调控蛋白，它在植物中参与多种生物进程的调控，其中包括植物的碳/氮代谢和胁迫应答。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有烟草14-3-3g基因的植物表达载体pk₂-35S-14-3-3g，同时提供该载体的构建方法，以及利用该载体制备快速吸收和耐受HCHO的转基因植物。

本发明所提供的载体含有烟草14-3-3g基因、CaMV35S强启动子，所述的14-3-3g基因的cDNA来源于烟草（Nicotiana tabacum），GenBank登录号为AF299256.1。

上述载体中，用于构建所属植物表达载体的起始载体为pMD18-T(购于大连TaKaRa生物公司)，用于构建所属植物表达载体的最终载体为pK₂GW₇（购自Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology，VIB）。

为了实现本发明的上述目的，本发明的技术方案如下：

1、植物表达载体的构建

（1）从GenBank中查找烟草14-3-3g基因的cDNA序列，并设计一对序列如下的引物。

上游引物5' GTCGACTCTAAACATGGCGGTGGC3'（含有Sal I位点）；

下游引物5' GATATCTCAATTTTTGGCTTCATCAGG3'（含有EcoR V位点）；

上游引物5’端添加Sal I（GTCGAC）酶切位点；下游引物5’端添加EcoR V（GATATC）酶切位点，以烟草第一链cDNA为模板扩增，得到14-3-3g基因的全长cDNA；

（2）回收并纯化14-3-3g全长基因cDNA片段，并将其连接到pMD18-T载体上，提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-T-14-3-3g；

（3）构建入门克隆载体pENTR-2B-14-3-3g，用EcoR V和Sal I酶切pMD18-T-14-3-3g和pENTR-2B，回收14-3-3g的cDNA片段，通过连接酶亚克隆到pENTR-2B，得到入门克隆载体pENTR-2B-14-3-3g；