[发明专利]一种体外酶反应生产D-(-)-乙偶姻的方法

说明书

本发明公开了一种体外酶反应生产D‑(‑)‑乙偶姻的方法，步骤为：(1)将载体pET28a与α‑乙酰乳酸合成酶编码基因alsS连接得到pET28a‑alsS并导入大肠杆菌，发酵，纯化，浓缩，得α‑乙酰乳酸合成酶浓缩液；将载体pET28a与编码α‑乙酰乳酸脱羧酶基因alsD连接得到pET28a‑alsD并导入大肠杆菌，发酵，纯化，浓缩，得到α‑乙酰乳酸脱羧酶浓缩液；(2)将上述两种浓缩液、丙酮酸钠、Mg²⁺和硫胺素焦磷酸混合均匀，反应，得到D‑(‑)‑乙偶姻。本发明以廉价的丙酮酸钠为底物，实现高附加值手性D‑(‑)‑乙偶姻的体外高效生产，产物手性纯度高。

技术领域

本发明属于生物工程技术与应用领域，具体地涉及一种体外酶反应生产D-(-)-乙偶姻的方法。

背景技术

乙偶姻，又名为3-羟基-2-丁酮，是一种无色或淡黄色液体，单体为无色或淡黄色液体，呈奶香气，是一种常用的食品级香料，添加到食物中，提升食物中的奶香味。同时，乙偶姻是美国能源部优先开发的平台化合物之一，尤其是手性乙偶姻(D-(-)-乙偶姻和L-(+)-乙偶姻) 广泛应用于功能材料，手性药物和化学中间体合成等领域。

目前，乙偶姻工业化生产的主要方法是化学合成法，包括2,3-丁二醇的氧化、丁酮的氯化水解法和丁二酮的部分加氢等方法。这些生产工艺操作较简便，但是能耗大，得率低且对环境有一定的污染，而且制得的乙偶姻多为两种手性异构体的混合物。近年来，许多研究者将目光转向既经济又环保的微生物发酵法生产手性乙偶姻。目前生产乙偶姻的菌株有大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、粘质沙雷氏菌、谷氨酸棒杆菌等。利用微生物法合成乙偶姻的报道很多，产量较高，但生产的乙偶姻手性纯度不高，且微生物代谢复杂，体内合成不易调控。Bae等^[1]在Saccharomyces cerevisiae中引入Bacillus subtilis的α-乙酰乳酸合成酶，α -乙酰乳酸脱羧酶和Lactococcus lactis的水合NADH氧化酶，并将副产物的合成途径阻断，使得乙偶姻的最终产量达到100.1g/L，但作者未检测乙偶姻的手性纯度。Guo等^[2]人，利用全细胞催化技术，在大肠杆菌中共表达meso-2,3-丁二醇脱氢酶，NADH氧化酶和透明颤杆菌血红蛋白。最终，93.73g/L的meso-2,3-丁二醇生产86.74g/LD-(-)-乙偶姻，手性纯度高达97.89％。但对底物meso-2,3-丁二醇的纯度要求较高，价格昂贵，不利于工业生产。

相比之下，基于纯化酶的合成生物系统具有明显的优势：产物得率高，过程耗费低，反应速率快，易控制，且产物易分离。这种环境友好型的生产平台已成功应用于很多生物能源和生物化学品的生产，如氢气，n-丁醇，1,3-丙二醇等。Jiao等^[3]人用乙酰乳酸合成酶和乙酰乳酸脱羧酶，首次在体外尝试利用丙酮酸生产乙偶姻，结果得到3.36mM(0.296g/L)的乙偶姻。虽然作者筛选了具有良好热稳定性的乙酰乳酸合成酶和乙酰乳酸脱羧酶，但来自 Caldicellulosiruptor owensensis OL的乙酰乳酸合成酶和来自Bacillussubtilis IPE5-4的乙酰乳酸脱羧酶对于底物的亲和性、底物特异性以及酶活均不令人满意。因此，乙偶姻的产量，转化率和得率也相对较低。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种体外酶反应生产D-(-)-乙偶姻的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种体外酶反应生产D-(-)-乙偶姻的方法，包括如下步骤：