[发明专利]一种培养具有单位高脲酶活性的巴氏生孢八叠球菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种培养具有单位高脲酶活性的巴氏生孢八叠球菌的方法。

背景技术

产脲酶微生物催化尿素的生化过程是微生物诱导碳酸盐沉淀技术的核心，可利用该过程诱发或控制岩土体中一系列化学反应，从而改善岩土体工程性质，其属于生物学和土木工程的交叉研究应用领域。巴氏生孢八叠球菌（Sporosarcina pasteurii），又称巴氏芽孢八叠球菌或巴氏芽孢杆菌，是该项技术最常用的微生物之一, 其单位脲酶活性越高，说明单个生物体可生产的脲酶值越高，越有利于相关工程应用。采用传统的通用培养方法如NH4-YE培养基单一培养基培养，培养结束后，巴氏生孢八叠球菌株的OD600值可达到5，但采用电导率法得到的脲酶产量结果一般仅为8-15 U/ml，单位脲酶活性（脲酶产量/OD值）为1.6-3 U/ml·OD，即按照通用培养方法的巴氏生孢八叠球菌株的单位生物量产脲酶的量值并不高。

为了提高巴氏生孢八叠球菌的单位脲酶活性，李萌等采用亚硝基胍诱变ATCC11859的巴氏芽孢八叠球菌；V Achal 等以MTCC 1761的巴氏芽孢八叠球菌为出发菌株，采用UV射线诱变。诱变方法均可以提高巴氏芽孢八叠球菌单位脲酶活性。但是，诱变方法操作复杂，随机性高，且亚硝基胍是一种强烈的致癌物质，对操作人员极易造成伤害。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足之处，提供一种培养具有单位高脲酶活性的巴氏生孢八叠球菌的方法。

本发明的目的是以下述方式实现的：

一种培养具有单位高脲酶活性的巴氏生孢八叠球菌的方法，具体步骤如下：

（1）配制A液体培养基和B液体培养基：

A液体培养基包括蛋白胨1-5 g/L、柠檬酸锂1-5 g/L、牛肉膏2-5 g/L、尿素10-20 g/L、氯化镍0.02-0.05 g/L，pH值为7-9；

B液体培养基包括甘露醇10-20 g/L、大豆蛋白胨20-30 g/L、氯化铵10-15 g/L、氯化镍0.02-0.05 g/L，pH值为7-9；

（2）向A液体培养基中加入琼脂粉混合均匀后，倒平板直至凝固为固体状态，用巴氏生孢八叠球菌母液在A培养基固体平板上划线，恒温培养12-16小时；然后从划线固体平板上挑单菌落，放置于装有A液体培养基的试管中，在有氧条件下培养12-16小时，恒温27℃-37℃；

（3）取步骤（2）振荡培养后的菌液，按照1%-5%的接种量接种于装有B液体培养基的锥形瓶中，在有氧条件下扩大培养15小时以上，恒温27℃-37℃，即可获得高脲酶活性的巴氏生孢八叠球菌液。

所述A液体培养基和B液体培养基均用氢氧化钠溶液调节pH值。

所述氢氧化钠溶液的浓度为0.004-0.006 mol/L。

步骤（2）中加入的琼脂粉的质量占A液体培养基的质量的百分比为1-2%。

相对于现有技术，本发明采用的是A和B顺序的双培养基培养巴氏生孢八叠球菌，在单菌落培养和菌种复活阶段（步骤（2））采用A培养基，在菌种扩大培养阶段（步骤（3））采用B培养基。试验结果证明该方法下巴氏生孢八叠球菌单位脲酶活性有巨大提升，且其操作简单、结果稳定，重复率高。

附图说明

图1是采用本发明的培养方法制得的巴氏生孢八叠球菌得生长曲线。

图2是不同培养时间条件下，不同培养基的巴氏芽孢八叠球菌脲酶活性的对比图。

图3是不同培养时间条件下，不同培养基的巴氏芽孢八叠球菌OD₆₀₀值的对比图。

图4是培养结束后，不同培养基的巴氏芽孢八叠球菌脲酶活性的对比图。

具体实施方式

本发明中使用的巴氏芽孢八叠球菌来源中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号1.3687。

实施例1：

一种培养具有单位高脲酶活性的巴氏生孢八叠球菌的方法，具体步骤如下：

（1）配制A液体培养基和B液体培养基：

A液体培养基包括蛋白胨1-5 g/L、柠檬酸锂1-5 g/L、牛肉膏2-5 g/L、尿素10-20 g/L、氯化镍0.02-0.05 g/L，pH值为7-9；

B液体培养基包括甘露醇10-20 g/L、大豆蛋白胨20-30 g/L、氯化铵10-15 g/L、氯化镍0.02-0.05 g/L，pH值为7-9；