[发明专利]一种可用于蛋白质生产的黑曲霉菌株及其应用

说明书

本发明提供了一种可用于蛋白质生产的黑曲霉菌株及其应用，属于基因工程领域。本发明的黑曲霉菌株敲除了fluG基因后得到的突变菌株具有蛋白质高产特性；进一步对该突变菌株基因组中引入糖化酶调控因子，得到的突变株FY17(ΔfluGamyR⁺)可以促进同源蛋白和异源蛋白的分泌；将FY17突变菌株敲除pepA基因后，得到的突变株也可显著提高异源蛋白和同源蛋白的分泌量；本发明还发现FY17 SP(ΔfluGΔpepAamyR⁺AnhapC⁺)可作为表达载体生产多种异源蛋白质。本发明的以敲除了fluG基因黑曲霉菌株为出发菌株的各突变株具有良好的生产同源和异源蛋白质的能力，具有良好的市场应用前景。

技术领域

本发明属于微生物基因工程改造技术领域，具体地说，涉及一种基因工程改造后的黑曲霉菌株及其在蛋白质生产中的应用。

背景技术

丝状真菌黑曲霉作为转化的宿主菌，相比其他微生物如细菌、酵母等有以下优势：黑曲霉有很强的胞外分泌蛋白能力，而细菌表达的重组蛋白往往以无活性的难溶的包含体形式存在；当细菌表达异源真核基因时，由于其翻译和转录不同于真核生物，所转入的基因可能无法正常表达，而丝状真菌不存在这种情况，丝状真菌能对表达蛋白进行正确的翻译后加工，包括肽连剪切和糖基化等后加工；与传统酵母相比，黑曲霉的糖基化模式与哺乳动物细胞相似，这对表达高级真核生物异源蛋白质尤其重要；黑曲霉具有像细菌一样的快速繁殖能力和短的生活周期，比动植物的细胞培养要简单；相比传统酵母和毕赤酵母，其蛋白质分泌量要高；许多丝状真菌如黑曲霉，米曲霉等被长期用与食品工业，被公认为安全微生物；黑曲霉具有成熟的上游基因改造优化特性，以及发酵和后提取纯化工艺。

黑曲霉作为一种腐生真菌，可以依靠多种碳源生长，对于生长环境适应性极强。作为商业微生物菌种已经被广泛应用于有机酸和酶制剂生产。随着基因工程技术的应用，黑曲霉作为理想的宿主菌株也被用于异源蛋白质的表达及生产。作为一种丝状真菌，黑曲霉主要通过菌丝尖分泌蛋白质或酶。之前的研究显示，无论是液态厌氧条件下所形成的微菌落(micro colony)或是好氧固态大型菌落(macro colony),菌落内部和外部转录组呈现明显差异。此外，大型菌落蛋白质分泌检测显示，蛋白质或酶分泌主要通过菌丝尖进行，并主要集中于菌落边缘。因此，如果能够使黑曲霉实现全菌丝体分泌以显著提升蛋白质或酶制剂的生产效率，目前还未有相关报道。

真菌生理学研究显示，黑曲霉孢子生成过程可抑制蛋白质分泌，因此如何抑制孢子生成代谢途径成为能否提高蛋白质分泌水平的关键。研究显示，作为扳机基因，fluG基因主要参与孢子生成相关的胞外信号传导。在构巢曲霉中，可以导致孢子生成出现障碍，在黑曲霉中敲除fluG基因，孢子生成传导途径并未受到显著影响。

amyR是一种丝状真菌GAL4型转录激活子，广泛存在于在曲霉家族中，在真菌降解植物多糖过程中起重要作用；当淀粉或麦芽糖作为碳源时，amyR可以激活糖化酶、α-淀粉酶和á-糖苷酶等。糖化酶在黑曲霉中具有胞外分泌的信号肽片段，因此是一种典型的分泌型蛋白质，可以作为异源蛋白质的载体实现向胞外分泌异源蛋白质，从而有利于大规模工业发酵和目标蛋白质的纯化。作为异源蛋白质分泌的载体，通过蛋白质融合技术，在糖化酶启动子GLA和糖化酶基因glaA之后嵌入外源蛋白基因，可有效的表达和分泌该异源蛋白质，同时通过特异的蛋白内切酶KexB(识别Lys-Arg位点)可以在发酵液中直接获得酶切后的游离异源蛋白质，进一步可优化KexB内切酶位点的序列(如在Lys-Arg前后增加特定氨基酸序列)，从而增强并达到100％内切效果，获得完全游离的目标蛋白质，从而简化后续纯化工艺和生产成本。

黑曲霉胞外分泌蛋白酶(aspergillopepsin)是工业生产异源蛋白质的主要挑战之一。黑曲霉主要胞外分泌的蛋白酶相关基因包括pepA,pepB和pepE。