[发明专利]SPKP‑XIII在制备Kv4.1通道抑制剂的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种活性多肽在离子通道工具试剂中的用途，尤其是用化学法制备的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钾肽-XIII（简写为SPKP-XIII）在制备电压门控钾通道工具试剂-Kv4.1型钾通道抑制剂中的用途。

背景技术

电压门控钾通道广泛分布于神经元、心肌、血管平滑肌、胰腺、骨骼肌等可兴奋性组织中，是一种重要的跨膜结构蛋白，其参与调节神经递质的分泌、血管收缩、胰腺分泌和骨骼肌兴奋性等多种生理过程,同时也是治疗药物作用的重要靶标之一。钾通道在动作电位的产生和传播过程中的关键性作用，电压门控钾通道成为很多动植物毒素的作用靶标。钾离子通道的结构与功能关系研究已经成为国际上的研究热点。电压门控钾通道很可能成为神经性和心血管等疾病的重要治疗靶点。自然界的动物毒素是一类具有很高实用价值和应用前景的工具试剂或药物导向物质，不仅是有毒动物抵御天敌的有力武器，也是从事神经生物学和生理学研究、天然创新药物开发以及蛋白质基础研究的宝贵材料,同时也是研究离子通道的独特“分子探针和解密器”。迄今为止，从多种动物（如蝎、蜘蛛、蛇以及海洋动物等）的毒液中鉴定到了很多作用于钾通道的活性成分。它们通过与钾通道的不同位置相结合从而引起通道的动力学特征发生相应的变化，如通道去失活、阻塞通道口、易化激活、失活延缓等。通过阐述这些特异性调制剂作用于钾通道的分子机制，除了在理论上可深入推测钾通道亚型之间的功能活动区别和门控活动机制外，还可以为将它们开发成治疗人类相关疾病的新药提供充分的理论基础和广阔的应用前景。

发明内容

本发明旨在于提供一种广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钾肽-XIII在制备电压门控钾通道工具试剂-Kv4.1型钾通道抑制剂的应用，所述的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钾肽-XIII（简写为SPKP-XIII），其氨基酸序列为：

NH₂-Glu Cys Arg Trp Leu Phe Gly Gly Cys Glu Lys Asp Ala Ser Asp Cys Cys Glu His Leu Gly Cys Arg Arg Ala Lys Pro Ser Trp Cys Gly Trp Asp Phe Thr Phe-NH₂,

其特征在于广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钾肽-XIII作为单一有效活性组份用于制备Kv4.1型钾通道抑制剂。

所述的蜘蛛抑钾肽-XIII的N端第2位半胱氨酸和第17位半胱氨酸之间，N端第9位半胱氨酸和第22位半胱氨酸之间，N端第16位半胱氨酸和第30位半胱氨酸之间分别形成二硫键。

该蜘蛛抑钾肽-XIII作为单一有效活性组分用于制备Kv4.1型钾通道抑制剂，以细胞外给药的方式制备成Kv4.1型钾通道工具试剂。

蜘蛛抑钾肽-XIII在制备Kv4.1型钾通道工具试剂或抑制剂时，配制细胞外给药的剂量为5 µmol/L。

蜘蛛抑钾肽-XIII抑制Kv4.1型钾通道的作用呈现浓度依从性。

蜘蛛抑钾肽-XIII对Kv4.1型钾通道的抑制呈现时间依从性，是一种较好的Kv4.1型钾通道工具试剂。

附图说明

图1是SPKP-XIII对Kv4.1钾通道亚型的影响.

图2是SPKP-XIII作用于 Kv4.1型钾通道的浓度-效应关系曲线。

图3是SPKP-XIII作用于 Kv4.1型钾通道的时间-效应关系曲线。

具体实施方式

为了更好的理解和更充分公开本发明，下面将通过细胞外给药途径，采用非洲爪蟾卵母细胞模型来说明蜘蛛抑钾肽-XIII的Kv4.1型钾通道抑制作用。

1、实验材料和方法

1.1通道质粒的扩增和提取

采用promega公司的质粒提取试剂盒（Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System）。

溶液的配方如下：

细胞重悬液细胞裂解液

Tris-HCl (pH 7.5) 50mMNaOH 0.2M

EDTA10mM1% SDS

RNase A 100µg/ml

中和液洗脱液

盐酸胍4.09M 乙酸钾 60mM

乙酸钾0.759MTris-HCl (pH 7.5) 8.3mM

冰醋酸2.12M EDTA 0.04mM

pH为4.2 加入95% 乙醇 ,终浓度为60%乙醇

操作步骤：