[发明专利]一种鲫鱼冠状病毒HB93及RT‑PCR检测引物及应用

说明书

技术领域

本发明属于病毒分子检测技术领域，具体涉及一种鲫鱼冠状病毒HB93及RT-PCR检测引物及应用。

技术背景

国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)于2012年发表了最新的病毒分类第九次报告，将套式病毒目(Nidovirales)中的冠状病毒科(Coronavi ridea)中新设冠状病毒亚科(Coronavirinea)和环曲病毒亚科(Torovirinae)。

冠状病毒科是一类线形单股正链RNA病毒，最早于1937年从鸡身上分离出来，Alme ida等对这些病毒进行了形态学研究，电子显微镜观察发现这些病毒的包膜上有形似日冕的棘突，故提出命名这类病毒为冠状病毒^[1]。1975年，国际病毒命名和分类委员会正式命名了冠状病毒科。2002-2003年期间，自我国局部地区发生的非典型肺炎，即由冠状病毒属的严重急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV)引起，世界上有30多个国家和地区相继报道出现病例，病死率超过10％。2012年，中东地区开始出现新型冠状病毒，病死率超过50％，引起了世界范围的广泛关注，造成社会对冠状病毒的恐慌。因此，对冠状病毒进行深入研究具有重要意义。

目前对冠状病毒科的研究主要集中在冠状病毒亚科，而对环曲病毒亚科研究甚少。其中，2006年鳊鱼病毒属(Bafinivirus)的中的鳊鱼病毒(White bream virus)由Schütze H等科学家在鳊鱼体内发现，这也是目前ICTV分类中确定的唯一以水生动物为宿主的冠状病毒。

目前鲫鱼冠状病毒(Crucian Carp Bafinivirus,CCBV)尚无公开报道，更也无有效的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种鲫鱼冠状病毒HB93，所述的病毒分离自鲫鱼病变细胞，该病毒已于2017年5月11日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：鲫鱼冠状病毒(Crucian Carp Bafinivirus)HB93，保藏编号：CCTCC NO：V201722，地址：中国武汉武汉大学。

本发明的另一个目的在于提供了基于鲫鱼冠状病毒HB93的全序列(SEQ ID NO.1所示)与其他病毒的全序列的差异设计的引物，利用该引物可用于检测鲫鱼冠状病毒HB93。

本发明的还有一个目的在于提供一种鲫鱼冠状病毒HB93RT-PCR检测引物，所述的引物为F1：5'-CAAAGTAAACCCTGGAGA-3'，R1：5'-ATCAATGATGGTGCAGTT-3'；F2：5'-TGAAACAATCCAAGAAGA-3'，R2：5'-ACAAGTTATAGCCGGTGT-3'。

本发明还有一个目的在于提供了鲫鱼冠状病毒HB93的应用，所述的应用包括利用该病毒制备成鲫鱼冠状病毒病疫苗，或是制备成鲫鱼冠状病毒的实验室对照品。

本发明的最后一个目的在于提供一种鲫鱼冠状病毒HB93RT-PCR检测引物的应用，包括利用所述的应用制备成鲫鱼冠状病毒检测试剂盒。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种鲫鱼冠状病毒HB93，所述的病毒分离自鲫鱼病变细胞，该病毒已于2017年5月11日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：鲫鱼冠状病毒(Crucian Carp Bafi nivirus)HB93，保藏编号：CCTCC NO：V201722，地址：中国武汉武汉大学。

将鲫鱼冠状病毒HB93(本发明或称为CCBV-HB93)接种到草鱼性腺细胞(Grass car p ovary cell line,GCO)单层，25℃培养7天，产生细胞病变效应(CPE)，可见GCO细胞收缩变圆、折光度增加，部分细胞开始脱落，细胞单层开始破裂。

培养基：M199，10％胎牛血清，pH 7.0～7.2。

鲫鱼冠状病毒HB93的形态特征：病毒呈棒状，四周有明显的日冕状棘突结构，与典型的冠状病毒形态相符。

鲫鱼冠状病毒HB93的应用，所述的应用包括利用该病毒制备成鲫鱼冠状病毒病疫苗，或是制备成鲫鱼冠状病毒的实验室对照品。

本发明的保护内容还包括基于鲫鱼冠状病毒HB93的全序列(SEQ ID NO.1所示)与其他病毒的全序列的差异设计的引物，所述的引物包括基于该差异序列，利用现有技术设计的诸如荧光定量引物，LAMP引物，数字PCR引物等，利用该引物可用于检测鲫鱼冠状病毒HB93。