[发明专利]一种动态调控3‑羟基丙酸合成的工程菌构建方法

说明书

技术领域

本发明设计一种动态调控3-羟基丙酸(3-Hydroxypropionic acid,3HP)合成的工程菌构建方法，具体涉及了基因工程技术领域。

背景技术

随着石油储量的枯竭和环境的恶化，世界各国都在致力于各种可再生能源的研究和开发。3HP是美国能源部提出的可再生生物质中12种增值平台化合物之一。3HP分子含有两个具有不同性质的官能团-羟基和羧基，使其成为许多光学活性物质的前体，如丙烯酸，1,3-丙二醇，3-羟基丙醛和丙二酸等。该化合物在化工行业的应用亦是多样化的，它用作聚合物涂料，金属润滑剂和纺织品抗静电剂等。此外，3HP是用在环化或聚合反应中生产丙内酯、聚酯和低聚物的初始材料，其中由3HP的自缩合产生的聚合物聚3HP酯具有良好的生物相容性和生物降解性，并可用于制造手术产品和药物释放材料。

传统的3HP生产一般通过化学方法合成，如β-溴丙酸水解法、2-氰基乙醇酸碱法、3-羟基丙醛氧化法和利用丙烯酸及β-羟基腈合成法等。然而，化学合成3HP具有耗能大、成本高、分离度低、对环境污染大等问题，在商业化生产上不具有可行性。3HP的生物生产的研究始于21世纪初，在不断研究中构建了多株重组大肠杆菌(Escherichia coli)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)，并以葡萄糖或甘油作为原料的生物合成途径用于各种代谢工程微生物的生产当中。其中大肠杆菌由于遗传背景清楚、重组子稳定、生长繁殖快等优点而被广泛研究利用。

我们前期研究3HP合成中发现，乙酸CoA转化为丙二酸单酰CoA效率低，限制下游产物积累。为了提高丙二酸单酰CoA合成效率，过表达acc，但是随着诱导剂IPTG浓度增加，却发现最终产物浓度逐渐减少。为了探寻其减少原因，我们分别将来自大肠杆菌和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的acc基因(即 acc_E和acc_S)以及不含acc基因的pE7a质粒分别在E.coli中进行表达，发现虽然高浓度IPTG对不合成丙二酸单酰CoA的对照菌体浓度有一定影响，但与对照相比，acc_E和acc_S的表达对宿主菌生长产生了明显的抑制。我们的研究结果证实了多篇文献报道的高浓度丙二酸单酰CoA抑制菌体生长的现象。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的转录因子FapR具有与丙二酸单酰CoA结合，影响RNA聚合酶调控启动子下游基因转录速率的特性。利用FapR与丙二酸单酰CoA相互作用这一特性，设计负反馈调节通路来控制丙二酸单酰CoA的合成与转化中两个关键酶：乙酰CoA羧化酶与丙二酸单酰CoA还原酶，解决菌体毒害和3HP产量偏低的问题。

发明内容

本发明目的在于运用合成生物学技术设计了一种动态调控3HP合成的工程菌构建方法。该方法利用生物传感器动态调控3HP的生物合成，能够降低生产成本、提高浓度和产量。

大量研究表明，过表达acc可提高丙二酸单酰CoA的浓度并改善3HP的产生；另一方面，acc的过表达对细胞有毒害作用。本发明为了增强丙二酸单酰 CoA供应，同时减轻由acc过表达引起的细胞毒性，基于来自革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌天然存在的丙二酸单酰CoA应答转录因子FapR设计了生物传感器，并用它负面调节acc表达，调控3HP的生物合成。当过表达重组质粒pE7a-acc 时，工程菌中积累过量丙二酸单酰CoA，此时生物传感器将打开重组质粒pBFR1k-lacI-FapR中lacI的表达，通过丙二酸单酰CoA与FapR的结合引发FapR 构象变化，导致FapR-DNA复合物解离，从而反过来下调acc，降低丙二酸单酰 CoA合成速率，减少菌体毒害。后续表达重组质粒pS2c-mcr，最终促进3HP的合成。

2017年6月7日将E.coli 3HP-0菌种保藏并登记入册到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，菌种保藏编号为CGMCC No.14224，分类命名为大肠埃希氏菌 (Escherichia coli)，该菌株的存活性经保藏中心于6月7日检测结果为存活。

为实现上述发明目的,本发明提供如下技术方案；

一种动态调控3HP合成的工程菌构建方法，其特征在于该方法按照以下步骤进行：

(1)纯化扩增出大肠杆菌中的accDA基因和accBC基因，构建得到重组质粒pE7a-acc，通过过表达acc合成中间产物丙二酸单酰CoA；