[发明专利]白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白在DENV2感染HaCaT细胞中的应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白促进登革病毒增殖的作用，其制备方法包括rAb‑34K2蛋白能促进DENV2在HaCaT细胞中增殖。其机制是抑制感染DENV2的HaCaT细胞表达Ⅰ型干扰素IFN‑α/β促进病毒增殖，同时rAb‑34K2蛋白能诱导感染DENV2的HaCaT细胞发生凋亡，对研究白纹伊蚊唾液蛋白组分在蚊虫传病机制中具有重要意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白在DENV2感染HaCaT细胞中的应用。

背景技术

蚊虫唾液蛋白具有抗凝血、抗炎、免疫调控的功能，是当前研究的热点。唾液腺转录组学和蛋白质组学研究均发现在伊蚊属蚊虫唾液腺中有一组雌蚊特异性高表达、分子量大小为34kDa但功能未知的唾液组分蛋白，故命名为34K蛋白家族。该蛋白编码基因均含有信号肽序列，表明其参与组成蚊虫唾液组分蛋白。白纹伊蚊俗称花脚蚊，因生性凶猛、攻击力强，也被称为“亚洲虎蚊”，是我国登革热的重要媒介。对白纹伊蚊唾液腺组学研究显示有两个34K蛋白存在于白纹伊蚊唾液内，分别命名为34K1，34K2。我们先前的研究发现蚊虫吸血可调控34K2蛋白的表达，但该蛋白在蚊虫吸血、传病中的作用并不清楚。为此，我们依据NCBI上白纹伊蚊34K-2成熟肽基因序列，原核克隆表达了该蛋白并分离纯化获得了有活性的重组蛋白，进而探讨了该重组蛋白在DENV2感染HaCaT细胞(人角质形成细胞)中的应用。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白 (以下简称rAb-34K2)在DENV2感染HaCaT细胞中的应用。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白在DENV2感染HaCaT细胞中的应用，其包括以下内容：

(1)包括白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白在DENV2感染HaCaT细胞中细胞增殖和抑制病毒增殖中的应用；

a)上述应用是利用实时无标记细胞动态分析法监测不同浓度的白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白对HaCaT细胞生长的影响；

b)对DENV2感染HaCaT细胞中抑制病毒增殖的应用，是通过 DENV2NS1基因/内参基因GAPDH RNA的比值对病毒核酸相对表达量进行统计学分析；

上述对病毒核酸相对表达量进行统计学分析，包括以下步骤：

①以感染DENV2的HaCaT细胞的RNA逆转录的cDNA为模板，用引物NS1 F(SEQ IDNO：1)和NS1R(SEQ ID NO：2)、引物GAPDH F(SEQ ID NO：3)和GAPDH R(SEQ ID NO：4)分别对NS1 基因和 GAPDH基因的进行PCR扩增；

②扩增产物经纯化回收后进行10^-3-10^-9的梯度稀释用作模板；

③用qRT-PCR检测不同浓度梯度下各基因的扩增参数，建立标准曲线；

④根据标准曲线对不同浓度白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白对 DENV2感染HaCaT细胞中病毒核酸进行动态检测并进行统计学分析；

(2)白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白在DENV2感染HaCaT细胞中调控细胞表达因子的应用；

上述应用是利用qRT-PCR实时检测不同浓度的白纹伊蚊唾液34K2 重组蛋白对DENV2感染HaCaT细胞中IFN-α/β、IL-1β、TNF-α、及IL-10 的mRNA变化的影响；qRT-PCR的反应程序为95℃，8min；95℃，30s； 60℃，30s；72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；

(3)白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白在DENV2感染HaCaT细胞中促进细胞凋亡的应用；