[发明专利]带永久电荷肼类糖标记物的制备方法及应用

说明书

本发明一种带永久电荷肼类糖标记物的制备方法，属于有机合成与生物信息技术领域。对氨基苯甲酸乙酯经过一系列合成，制备成带永久电荷肼类糖标记物，本发明制备的肼类化合物具有反应条件温和(5％乙酸，80℃，3小时)，可以显著提高灵敏度，且反应过后无需进一步纯化处理就可以直接用高效液相色谱和质谱(ESI‑MS，MALDI‑ToF‑MS)进行检测，灵敏度好。

技术领域

本发明属于有机合成与生物信息技术领域，具体涉及一种带永久电荷肼类糖标记物的制备方法。

背景技术

化学衍生在蛋白质组学和糖组学的研究中起着重要的作用，尽管检测仪器的发展日新月异，但没有各种衍生技术的辅助，许多微量存在的肽段或糖类是无法检测的，不仅如此，衍生后的样品也不能够在检测中表现出更高的灵敏度与检测强度。

样品带永久电荷的可以在离子化和解离过程中排除钠离子和钾离子的干扰，还能提高检测灵敏度，常用的衍生试剂TMPP(tris(2,4,6-trimethoxyphenyl)Phosphoniumacetic acid N-hydroxysuccinimide ester)是一个带永久电荷琥珀酯类衍生试剂的应用，该衍生试剂的灵敏度有了显著提高，且琥珀酯基团是一个较为活泼的基团，反应条件为40℃、20分钟，非常温和，是一个稳定可靠的衍生试剂，但是其衍生效率只有约90％，且该衍生试剂成本高，限制其应用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种带永久电荷肼类糖标记物的制备方法及应用，为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究和不懈探索，最终获得了如下技术方案：

a、称取1g对氨基苯甲酸乙酯于二口圆底烧瓶中，加入40ml丙酮溶解，接着加入3.6g无水碳酸钾和14.1g碘甲烷，反应在氮气保护下于80℃搅拌回流24小时，反应完毕，过滤反应液，取滤液，用二氯甲烷萃取，有机相用硫酸镁除水，滤除硫酸镁后蒸发浓缩，产物用层析柱分离纯化(流动相二氯甲烷:甲醇＝20:1)，得到产物A。

b、在产物A中按1:20摩尔比加入80％水合肼，95％乙醇为溶剂，反应在氮气保护下90℃回流反应，反应完成后层析柱纯化(流动相二氯甲烷:甲醇＝20:1)得到产物B。

c、在产物B中加入按1.2倍摩尔比的二叔丁基二碳酸酯，以超纯水为溶剂，在室温下搅拌，反应50分钟，得产物C。

d、在C产物中加入5倍摩尔比的碘甲烷，丙酮作溶剂，室温下搅拌并避光反应24小时，过滤，得产物D。

e、在D产物中加入等摩尔量的三氟乙酸，反应用二氯甲烷作溶剂，室温下搅拌，反应1小时，反应液蒸干，而后再次加入适量甲醇溶解，用三乙胺调节反应液PH至8-9，室温搅拌反应5分钟，除去溶剂得最终产物E。

一种带永久电荷肼类糖标记物的制备方法，具体反应如下：

一种带永久电荷肼类糖标记物的应用，该标记物可应用于蛋白质组学中糖肽和糖蛋白以及多糖的衍生。

与现有技术相比，本发明的优点为：

1、本发明制备的带永久电荷肼类化合物具有反应条件温和(5％乙酸，80℃，3小时)，可以显著提高灵敏度，且反应过后无需进一步纯化处理就可以直接用高效液相色谱和质谱(ESI-MS，MALDI-ToF-MS)进行检测，灵敏度好，上样量5pmol(5ng麦芽七糖)可以获得分辨率很好的结果。

2、反应体系纯净，检测之前不需要纯化，可以节省4-5个小时的人工操作时间。

3、本发明衍生试剂的合成路线较为简单，原料易于得到且价格不高。

附图说明

图1为带永久正电荷的肼类试剂衍生的麦芽七糖(*衍生后的天冬酰胺多糖)。