[发明专利]一种猪肺炎支原体疫苗效力测定方法

说明书

本发明公开了一种猪肺炎支原体疫苗效力测定方法，属于生物技术领域，本发明方法包括以下步骤：（1）免疫动物；（2）血清采集、稀释；（3）支原体‑血清结合、培养；（4）结果判定。本发明使用血清学方法替代动物试验，操作简单，技术要求低，重复性强，特异性好，该方法的建立避免了免疫攻毒保护法结果判定的主观性，避免散毒，同时也为制定、优化仔猪免疫程序提供了依据，适用于普遍推广。

技术领域

本发明涉及一种疫苗效力的测定方法，尤其是一种猪肺炎支原体疫苗效力测定方法，属于生物技术领域。

背景技术

猪支原体肺炎(Swine enzootic hyopneumoniae)，我国俗称猪喘气病，是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mh)引起的一种慢性、接触性、呼吸道传染病，主要临床表现为咳嗽、气喘，猪只感染后往往会生长发育迟缓，饲料转化率严重降低，导致重大的经济损失。且猪只一旦感染支原体极易继发其他病毒和细菌感染，从而导致死亡率升高。国内外资料及大量临床数据表明，疫苗免疫是预防本病最重要的手段。

国内外猪肺炎支原体疫苗免疫效果评价标准不一，常用的方法有：仔猪免疫攻毒法、家兔IHA测定法、ELISA抗体检测法。仔猪免疫攻毒法的弊端是攻毒需要有负压的环境，攻毒技术难以掌握，并且每次需要剖杀试验猪计算肺部病变减少率，受主观影响大，检测周期长，成本高，重复性差；家兔IHA测定法以家兔做为实验动物，为非靶动物，不能准确反应疫苗真实效力；ELISA抗体检测法测定疫苗的相对效力，而ELISA检测法受试剂盒批间差异的影响，重复性差，且多处文献报道ELISA抗体水平与疫苗保护水平不相关。

因此，亟需建立一种操作简单，重复性强，特异性强且易于普遍推广的检验方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有效力测定方法之缺陷，提供一种新型的猪肺炎支原体疫苗效力测定方法，以提高检测精确度，缩短检测周期。

本发明所述技术问题是由以下技术方案解决的。

一种猪肺炎支原体疫苗效力检测方法，它包括以下步骤：

（1）免疫动物

筛选猪肺炎支原体抗原抗体阴性动物作为实验动物，用所述猪肺炎支原体疫苗对实验动物进行免疫。

（2）血清采集、稀释

免疫程序结束后，无菌采集动物血清，灭活，用PBS对血清做倍比稀释，得到不同稀释度的血清，作为待检样品。

（3）支原体-血清结合、培养

取待检样品与猪肺炎支原体检测用抗原等体积混合，每个样品设置复孔，同时设阴、阳性对照。将培养板密闭，恒温培养，定期观察。

（4）结果判定

试验成立条件：阳性对照孔均变为黄色，阴性对照孔均不变色。

判定时间：当阳性对照孔全部变为黄色时进行结果判定。

判定标准：将不变色孔的待检样品最高稀释倍数判定为所述待检样品的效价。

优选地，步骤（1）中所述实验动物为仔猪、家兔、种公猪或空怀母猪。

优选地，步骤（2）中所述血清采集时间优选免疫程序结束后28～35d，例如28d、30d、32d和34d等。

优选地，步骤（2）中所述待检血清做2~10倍系列倍比稀释，优选2～5倍系列稀释。

优选地，步骤（3）中所述猪肺炎支原体检测用抗原为猪肺炎支原体培养物用液体培养基稀释所得，其活菌滴度优选10~10000CCU/ml，更优选100~5000CCU/ml，进一步优选500~1000CCU/ml。