[发明专利]一种利用生物柴油副产物制备金合欢烯的方法

权利要求书

1.一种利用生物柴油副产物制备金合欢烯的方法，其特征在于包括步骤如下：

(1)构建合成金合欢烯的重组宿主细胞：

构建三种在同一宿主细胞中兼容的重组质粒，包括33-pMvaE-S、4-pEEM和28a-FII；所述的重组质粒33-pMvaE-S含有两个基因，包括MvaE酶基因和MvaS酶基因，其araC启动子所携带的外源基因碱基数为3564bp；所述的MvaE酶基因和MvaS酶基因选自粪肠球菌；所述的MvaE酶基因的DNA序列为seq.23；所述MvaS酶基因的DNA序列为seq.24；所述的araC启动子序列为seq.1；所述的重组质粒4-pEEM含有三个基因，包括甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因，其T7启动子所携带的外源基因碱基数为3879bp；所述的甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因选自酿酒酵母；所述的甲羟戊酸激酶基因的DNA序列为seq.20；所述的磷酸甲羟戊酸激酶基因的DNA序列为seq.21；所述的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因的DNA序列为seq.22；所述的T7启动子序列为seq.7；所述的重组质粒28a-FII含有三个基因，包括金合欢烯合成酶基因、金合欢烯焦磷酸合成酶基因和异戊烯焦磷酸异构酶基因，其T7启动子所携带的外源基因碱基数为3174bp；所述的金合欢烯合成酶基因选自青蒿素cDNA序列；所述的异戊烯焦磷酸异构酶基因，金合欢烯焦磷酸合成酶基因选自大肠杆菌；所述的金合欢烯合成酶基因的DNA序列为seq.25；所述的异戊烯焦磷酸异构酶基因的DNA序列为seq.16；所述的异戊烯焦磷酸异构酶基因的DNA序列为seq.17；所述的三种重组质粒携带外源基因的碱基数均在3000-4000bp范围内，均在启动子araC和T7转录能力的范围内；所述的三种重组质粒转化导入宿主细胞中获得合成金合欢烯的重组宿主细胞F3；

(2)将重组宿主细胞F3接种到含有纯化后生物柴油副产物的培养基中进行异源诱导表达金合欢烯。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的宿主细胞是大肠杆菌；所述的大肠杆菌是大肠杆菌DH5a。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的重组质粒33-pMvaE-S是将MvaE酶基因和MvaS酶基因通过pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Ki技术手段构建至常用空载质粒pBAD-33所得的；所述的重组质粒4-pEEM是将甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因通过pEASY-Uni Seamless Cloning and AssemblyKi技术手段构建至常用空载质粒pBBR1MCS-4所得的；所述的重组质粒28a-FII是将金合欢烯合成酶基因、金合欢烯焦磷酸合成酶基因和异戊烯焦磷酸异构酶基因通过pEASY-UniSeamless Cloning and Assembly Ki技术手段构建至常用空载质粒pET-28a所得的。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述纯化的方法如下：

a.通过离心除去生物柴油副产物中的不溶性物质；

b.通过蒸馏方法除去生物柴油副产物中的甲醇；

c.通过加入磷酸中和已除去甲醇的生物柴油副产物，离心分离，获得纯化后生物柴油副产物，用于金合欢烯制备。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的生物柴油副产物的主要成分包括20％～50％的甘油、10％～35％的甲醇、碱性催化剂和5％～30％的皂；所述的离心条件是离心转速3000～15000rpm，离心时间5～60min；所述的磷酸浓度为5～60％。