[发明专利]基于核酸层析生物传感技术检测产气荚膜梭菌的方法

说明书

本发明涉及一种基于核酸层析生物传感技术检测产气荚膜梭菌的方法，根据产气荚膜梭菌的毒力基因cpa，设计环介导等温扩增引物(SEQ ID NO:1‑4)，结合纳米酶核酸试纸条，建立一种基于LAMP纳米酶传感器的产气荚膜梭菌检测方法。本方法可成功地用于区分活菌细胞和死菌细胞，对产气荚膜梭菌的检测下限可达10CFU/mL。

技术领域

本发明涉及生物传感检测技术领域，具体地说，涉及一种基于核酸层析生物传感技术检测产气荚膜梭菌的方法。

背景技术

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是临床上气性坏疽病原菌中最多见的一种梭菌，因能分解肌肉和结缔组织中的糖，产生大量气体，导致组织严重气肿，继而影响血液供应，造成组织大面积坏死。为革兰阳菌粗短大杆菌，大小(1～1.5)μm×(3～5)μm。两端钝圆，单个或成双排列，偶见链状。芽胞椭圆形，位于菌体中央或次极端，芽胞直径不大于菌体，在一般培养时不易形成芽胞，在无糖培养基中有利于形成芽胞。在机体内可产生明显的荚膜，无鞭毛，不能运动。产气荚膜梭菌既能产生强烈的外毒素，又有多种侵袭性酶，并有荚膜，构成其强大的侵袭力，引起感染致病。

传统的细菌检测方法主要根据生理生化特征，但是传统的检测方法需要经过前增菌、选择性平板分离、生物化学鉴定等步骤，从取样到确定结果需要5-7天，检测周期长，操作繁琐，工作量大；利用抗原抗体反应的特异性，对细菌进行鉴别，已有了半个多世纪的历史，但是微生物抗体的筛选十分繁琐，并且最终的检测特异性不高；分子生物学检测技术的不断完善和发展，克服了传统检测方法实验操作繁琐、耗时长等问题，也使得针对微生物开展的快速检测方法得到迅速发展，但是分子生物学方法的缺点在于不容易分析结果。随着现代生物技术的发展，生物传感器这一比传统方法更快捷、更灵敏的新技术在食品安全检测领域崭露头角。生物传感器具备特异性强、灵敏度高等优点，可以简化分析检测步骤，缩短分析时间，更重要的是使在线实时检测成为可能，便于携带和野外作业，在食品安全领域得到了较快的发展。近年来，众多新材料、新技术的开发和应用正成为研究的热点为生物传感器的发展注入了新的活力，在微生物检测领域显示出巨大的应用潜力。因此建立产气荚膜梭菌可靠的、快速的传感器检测方法，特别是能够鉴定死活菌的方法，在日常监控、市场筛查等方面具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于核酸层析生物传感技术检测产气荚膜梭菌的方法。

本发明构思如下：开发一种产气荚膜梭菌的快速和超灵敏检测方法，特别是能够鉴定死活菌的方法，建立基于叠氮碘化丙啶(PMA)，环介导等温扩增反应(LAMP)和纳米酶试纸的活菌检测的连续级联纳米酶生物传感器。在LAMP反应中，使用荧光素(FITC)修饰的和生物素(BIO)修饰的引物测定产气荚膜梭菌的cpa基因。将PMA与LAMP组合，应用于死活产气荚膜梭菌的分离。然后，使用纳米酶探针制备基于磁性颗粒的免疫层析条(纳米酶条)用于检测扩增信号，通过目视检测或利用条形读出器进行结果判读或定量，为现场检测产气荚膜梭菌活菌提供快速、超灵敏和便捷的工具。

为了实现本发明目的，本发明首先提供用于检测产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)的LAMP引物组，包括(SEQ ID NO:1-4)：

外侧正向引物F3：5’-CTAGATATGAATGGCAAAGAGG-3’；

外侧反向引物B3：5’-AGATATCAGCATAAAAATCCTCA-3’；以及

内侧正向引物FIP：5’-GGCAGTAACATTAGCAGGATGATATTAAACAAGCTACATTCTATCTTGG-3’；

内侧反向引物BIP：5’-TGATAGCGCAGGACATGTTAAGTTTGCAACCTGCTGTGTT-3’。

其中，引物FIP的5’端标记生物素，引物BIP的5’端标记荧光素FITC。