[发明专利]pcDNA4Myc‑NCAM质粒在制备关节炎药物中的应用及该质粒的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术，具体涉及pcDNA4/Myc-NCAM质粒在制备关节炎药物中的应用及该质粒的制备方法。

背景技术

关节炎是一种常见的关节变性疾病，以软骨进行性破坏为主要特点。软骨的分化形成在关节炎的发病与治疗中有着重要的作用。在健康人中，关节软骨细胞正常增殖、正常分化形成软骨；而在关节炎患者中(即炎症环境下)，软骨细胞不断增殖而且软骨细胞过度肥大，软骨肥大标志物(hypertrophic chondrocyte markers)如RunX2和Collagen X等异常高表达，并伴随钙沉积的显著增多。疼痛是关节炎最主要的表现。关节疼痛及炎症引起的关节周围组织水肿，导致关节活动受限。慢性关节炎患者由于长期关节活动受限，可能导致永久性关节功能丧失。可出现红斑、畸形、软组织肿胀、关节红肿、渗液、骨性肿胀、骨擦音、压痛、肌萎缩或肌无力、关节活动范围受限及神经根受压等体征。

神经细胞粘附分子(neural cell adhesion molecule,NCAM；即CD56)属于免疫球蛋白超家族中的一员。NCAM在神经细胞中起着非常重要的作用，包括：神经退化、迁移、分化、增殖、细胞粘附、信号传导以及学习和记忆的调节。

我们发现神经细胞粘附分子(neural cell adhesion molecule,NCAM)能抑制炎症诱导的软骨细胞过度肥大分化。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了pcDNA4/Myc-NCAM质粒在制备关节炎药物中的应用及该质粒的制备方法。

pcDNA4/Myc-NCAM质粒在制备缓解关节炎症药物中的应用。

pcDNA4/Myc-NCAM质粒在制备治疗关节炎症药物中的应用

pcDNA4/Myc-NCAM质粒的制备方法，其特征在于，从大鼠cDNA文库中扩增NCAM基因，将扩增出来的片段连接到pcDNA4/Myc真核表达载体上，转化感受态TOP10，氨苄霉素抗性LB琼脂板筛选单克隆菌落，摇菌并提取质粒。

附图说明

图1：ATDC5细胞中NCAM过表达。

图2A：NCAM缓解IL-1 β刺激的软骨细胞肥大标志物RunX2mRNA的表达。

图2B：NCAM缓解IL-1 β刺激的软骨细胞肥大标志物Col10a mRNA的表达。

图3A：NCAM缓解IL-1 β刺激的软骨细胞肥大标志物蛋白质RunX2和Col X的表达。

图3B：NCAM缓解IL-1 β刺激的软骨细胞肥大标志物蛋白质Col X的表达。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做详细说明。

材料与试剂

pcDNA4/Myc载体购自Addgene；ATDC5细胞购自日本细胞库RIKEN Cell Bank；DMEM/F12 培养基购自HyClone，胎牛血清(FBS)购自Gibco，0.25％胰蛋白酶(含EDTA)、青霉素-链霉素、细胞裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、蛋白上样缓冲液购自上海碧云天生物技术有限公司，Bradford购自BIO-RAD公司；逆转录试剂盒、real-time PCR试剂盒购自南京爱必梦生物材料有限公司；ITS诱导液、茜素红购自Sigma公司；Trizol试剂和Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；Runx2和β-actin抗体购自于CST公司，COLX抗体购自Abcam 公司，NCAM抗体购自上海生工生物工程有限公司。

表达质粒pcDNA4/Myc-NCAM的构建

根据GenBank中NCAM基因的mRNA序列(NM_001081445.1)，并利用DNAMAN 8.0软件设计引物，从大鼠cDNA文库中扩增NCAM基因，将扩增出来的片段连接到pcDNA4/Myc真核表达载体上，转化感受态TOP10，氨苄霉素抗性LB琼脂板筛选单克隆菌落，摇菌并提取质粒，进行质粒酶切验证及电泳分析。将阳性质粒送苏州金唯智生物科技公司测序。

细胞培养与软骨细胞诱导分化

ATDC5细胞用含5％FBS、100U/mL青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基，置于37℃、5％CO₂饱和湿度的细胞培养箱培养。