[发明专利]一种基于TALENs基因编辑花生育种方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于TALENs基因编辑花生育种方法，属于农业生物工程技术领域。

背景技术

花生又名落花生，属一年生草本植物，是我国重要的油料和经济作物。我国的花生种植面积和生产总量均居世界前列在国际上具有很强的竞争力。油酸是花生油脂中的主要脂肪酸，因为油酸具有较好的氧化稳定性，从而减少脂质氧化，从而解决花生制品在生产和储存期间由于脂质氧化而产生的不良的气味、口味及货架期缩短等问题。油酸还是一种单不饱和脂肪酸能降低身体低密度脂蛋白(LDL)水平，维持高密度脂蛋白(HDL)水平。所以高油酸花生不仅可以有效延长花生制品的保质期和货架期，同时也有益于人们的身体健康。选育高油酸花生新品种是花生育种的重要目标之一。目前已知FAD2(Δ12脂肪酸脱氢酶)是脂肪酸生物合成途径中催化油酸在第12碳位脱氢，形成双键向亚油酸基转变的关键酶。传统育种思路是通过自然突变体(如美国筛选出来的F435)或者通过诱变筛选出来的高油酸突变体进行杂变，回交改良，这些育种方法都存大育种效率低，时间较长等缺点。

花生是异源四倍体植物，高油酸花生中FAD2A基因起始密码子后448bp处G:C→A：T的替换使得D150N氨基酸的变异，FAD2B基因起始密码子后442bp处A插入，使得终止密码子提前出现，从而使得fad2基因的表达降低或功能丧失。传统的杂交育种方法需要很难做到精准突变，并且费时费力。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种提高花生油酸的基于TALENs基因编辑花生育种方法。

实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：

一种基于TALENs基因编辑花生育种方法，包括以下步骤：

1)TALENs左右臂序列的设计：分析花生品种的fad2基因的序列，并设计左右臂序列；

2)组装至表达载体：将步骤1)得到的左右臂序列组装至植物表达载体并转染农杆菌，得到含有转化质粒的农杆菌；

3)遗传转化：将步骤2)得到的含有转化质粒的农杆菌遗传转化至花生种子；

4)选育：根据目标性状选育。

作为优选，步骤1)中，所述左右臂序列中左臂序列为SEQ ID No.1，右臂序列为SEQ ID No.2。

作为优选，步骤1)中，所述左右臂序列中左臂序列为SEQ ID No.3，右臂序列为SEQ ID No.4。

作为优选，步骤2)中，所述表达载体为pCAMBIA3301或pCAMBIA1301。

作为优选，步骤3)中，遗传转化的具体操作为：

a)用花生种子制作外植体；

b)将含有转化质粒的农杆菌接种至YEP培养基培养，收集菌体，将菌体重悬于含有乙酰丁香酮的液体MS培养基中，得到侵染液；

c)将外植体浸浮于侵染液，共培养，得到共培养后外植体。

作为优选，步骤c)中，共培养前，向侵染液加入0.1wt％的silweet L-77。

作为优选，步骤4)中，所述目标性状为油酸含量大于60％。

本发明的配方设计原理如下：

本发明将已经发布花生的fad2基因序列在NCBI数据库和花生野生种基因库进行比较，为了使得fad2基因失去功能，同时避开fad2A和fad2B的SNP位点，在fad2基因序列的起始密码子附近，共设计以下几条左右两臂的识别序列，通过两两组合的方式找到最佳的基因编辑。

其中，其中L1R1的间隔距离为13bp,L1R2的间隔距离为14bp，L2R1的间隔距离为16bp,L2R2的间隔距离为17bp,L3R1的间隔距离为14bp,L3R2的间隔距离为15bp。

本发明将已经发布花生的fad2基因序列在NCBI数据库和花生野生种基因库进行比较，为了使得fad2基因失去功能，同时避开fad2A和fad2B的SNP位点，在fad2基因序列的起始密码子附近，共设计以下几条左右两臂的识别序列，通过两两组合的方式找到最佳的基因编辑。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种能有效提高花生油酸含量的基因编辑方法，该高油酸含量的性状可稳定地遗传至子代。

附图说明

图1为L1R1为载体编辑粤油7号的T0代种子油酸含量。

图2为L2R2为载体编辑粤油7号的T0代种子油酸含量。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：