[发明专利]一种检测核酸外切酶I的荧光传感方法

说明书

本发明公开了一种检测核酸外切酶I(Exo I)的荧光传感方法，特点是具体步骤如下：(1)将阳离子共轭聚合物(CCP)与铱配合物混合，然后加入Exo I缓冲液，得到用于检测Exo I的基于CCP与铱配合物荧光共振能量转移(FRET)效应的荧光传感器体系。检测荧光强度；(2)加入单链DNA(ssDNA)到步骤(1)中的体系，检测荧光强度的变化；(3)不同浓度的Exo I加入到步骤(2)中，检测样品中Exo I的活性，优点是第一次发明了一种特异性好、灵敏度高、检测速度快，结果准确可靠的分析传感方法用于Exo I的检测。

技术领域

本发明涉及荧光生物传感器，尤其是涉及一种检测核酸外切酶I(Exo I)的荧光传感方法。

背景技术

核酸外切酶(Exonucleases)是一类从多核苷酸链的一头开始按序催化降解核苷酸的酶。核酸外切酶分为：核酸外切酶I(Exo I)和核酸外切酶III(Exo III)。Exo I是一种仅能从单链DNA(ssDNA)的3’端到5’端，按照碱基顺序，逐个催化水解碱基间的磷酸二酯键，逐渐降解ssDNA的酶。Exo I水解ssDNA后，最终产物是逐个脱氧核糖核苷酸。Exo I对ssDNA的碱基序列是没有要求的，不具有水解双链DNA的能力。核酸外切酶在生物学的很多过程中起着重要的作用，如DNA复制、重组、修复等。其中最重要的功能就是维持生物体内的基因突变几率，从而维持遗传信息的稳定性。近年来，相继报道了Exo III的定量检测，然而Exo I的研究还很少。

目前对Exo I的活性检测普遍缺乏定量描述，因为传统检测Exo I活性的方法是将标准的DNA与核酸外切酶反应，凝胶电泳观察酶切效果，这种方法最多给出半定量结果，而且操作麻烦、重现性差，更不能实时给出不同条件下的酶活性变化。因此，发展一种快速、准确、灵敏的定量检测Exo I活性的方法，将有重要价值。

铱配合物具有发光效率高、较大的Stokes位移、发光颜色可以通过改变配体结构进行调节以及良好的光稳定性等优点而成为研究的热点。根据报道，铱配合物在生物传感器方面的应用越来越广泛。阳离子共轭聚合物(CCP)作为一种新型的水溶性荧光分子，具有摩尔吸光系数大、荧光量子产率高等优点。同时，共轭聚合物具有分子导线的功能，能够实现荧光信号的放大。铱配合物和CCP可以发生荧光共振能量转移(FRET)现象。

本发明基于铱配合物和CCP的FRET现象，构建一种简单、高灵敏、快速的分析传感方法，用于定量检测Exo I，过程及其简单，为临床应用提供了一种很有前景的检测手段。目前，基于铱配合物和CCP的FRET现象检测Exo I活性的荧光传感器尚未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠的检测Exo I的荧光传感方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种检测Exo I的荧光传感方法，具体步骤如下：

(1)将85～95μL浓度为3～4μM CCP与0.5～2μL浓度为0.5～2mM铱配合物混合，然后加入相应体积的10×Exo I缓冲液，得到100μL用于检测Exo I的基于CCP与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系。检测荧光强度，计算CCP(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值。

(2)加入1～3μL 5～15μM的ssDNA到步骤(1)中的体系，检测荧光强度的变化，计算CCP(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值。

(3)不同浓度的Exo I加入到步骤(2)中，然后加入相应体积的10×Exo I缓冲液，30～40℃下温育25～35min，检测荧光强度的变化，计算CCP(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值，获得一系列不同浓度的Exo I对应的荧光强度比值，建立荧光强度比值与Exo I浓度之间的定量关系；根据这个定量关系可以检测样品中Exo I的活性。