[发明专利]高产γ-PGA菌株及应用其生产γ-PGA的方法

权利要求书

1.一种高产γ-聚谷氨酸的芽孢杆菌，Bacillus sp. JX-12，其在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNO.13716，保藏日期为2017年3月16日。

2.一种如权利要求1所述的高产γ-聚谷氨酸的菌株在生产γ-聚谷氨酸中的应用。

3.根据权利要求2所述的高产γ-聚谷氨酸的菌株在生产γ-聚谷氨酸中的应用，其特征在于：生产γ-聚谷氨酸的步骤如下：

1）、种子培养：将菌株JX-12接种于无菌的活化培养基斜面，在30-37℃条件下培养24-48小时活化，将已活化的菌种接种于无菌的种子培养基，在30-37℃、150-250rpm的条件下摇瓶培养24-48小时，即得种子液；

所述的活化培养基配方为：蛋白胨 10g，牛肉膏 5g， NaCl 5g，琼脂 18～20g，pH 6.8～7.4，补水至 1000mL；所述的种子培养基配方为：蛋白胨 10g，牛肉膏 5g， NaCl 5g，pH7.0～7.4，补水至 1000mL；

2）、固定化细胞制备：将种子液离心，弃上清液，用无菌的0.9%生理盐水冲洗3-4次，用无菌水将菌体悬浮，并稀释至浓度为10⁵ -10⁷cfu/mL，将菌悬液与载体材料混合均匀，交联固化形成颗粒，用无菌水清洗固化颗粒3-4次，转移至0.9%的生理盐水中，于4℃冰箱保存备用；

3）、木质纤维素材料预处理：取木质纤维素材料，用自来水清洗，然后粉碎、过40目筛、预处理、脱毒，之后在60-90℃下干燥至恒重，常温保存备用；所述木质纤维素材料为玉米秸秆、玉米芯、小麦秸秆、水稻秸秆、高粱秸秆、油菜秸秆、甘蔗渣、木屑中的一种或多种混合；所述预处理为稀酸预处理、稀碱预处理、离子液预处理、蒸汽爆破预处理、氨纤维膨爆预处理、生物预处理中的一种，所述脱毒为水洗脱毒、过碱化处理、活性炭吸附、生物脱毒中的一种；

4）、同步糖化、过滤与发酵：

第一、预水解：将预处理的木质纤维素材料加入水解反应器中，用蒸馏水稀释至固体含量5%-12%，加入纤维素酶10-35FPU/(g底物)，加入消泡剂，在50-55℃下搅拌100-200rpm，通过2M的NaOH和2M的HCl维持水解反应体系pH为4.5-5.5，在与发酵罐整合同步发酵前预水解24-48h；

第二、发酵罐灭菌：发酵罐中加入不含主要碳源的发酵培养基，所述培养基的配方为：柠檬酸 5g，谷氨酸 20g，硫酸铵 10g， K₂HPO₄ 1g，MgSO₄•7H₂O 0.5g，FeCl₃•6H₂O 0.02g，MnSO₄•H₂O 0.1g，CaCl₂ 0.2g，补水至1000mL；加入消泡剂，使用蒸汽将发酵罐及培养基121℃灭菌20-40min，冷却待用；

第三、同步糖化、过滤与发酵：预水解后，将固定化的γ-聚谷氨酸菌株接种到培养基中，进行同步糖化、过滤与发酵；

使用蠕动泵将水解反应器中木质纤维素-酶混合物泵入错流膜过滤装置中，流速为5-30L/min，滞留物泵回水解反应器，含糖的滤出液以0.5-35mL/min的流速泵入发酵罐，供菌体发酵使用；同时发酵罐中液体以与滤出液相同的流速泵入水解反应器中，维持体系的平衡；发酵罐中搅拌速度为400-600rpm，通气量为1-1.5vvm，温度为30-37℃，pH通过自动流加2M NaOH维持在5.5-7.0；发酵72-96h；

第四、连续批次发酵：

发酵72-96h后，取出发酵罐中的发酵液，将固定化的γ-聚谷氨酸留在发酵罐中，加入已灭菌的不含主要碳源的培养基，水解反应器中补充木质纤维素材料和酶，继续进行同步糖化、过滤与发酵48-72h，重复该操作，进行连续发酵。

4.根据权利要求3所述的高产γ-聚谷氨酸的菌株在生产γ-聚谷氨酸中的应用，其特征在于：所述的固定化细胞制备过程中采用的载体材料为海藻酸钠、海藻酸钙、聚乙烯醇、卡拉胶、聚氨酯泡沫、活性炭、陶瓷颗粒等的一种或多种。