[发明专利]具多项功能的白桦SPL8基因及其编码蛋白

说明书

技术领域：本发明涉及一个具多项功能的白桦SPL8基因及其编码蛋白，属于分子生物学中的基因技术领域。

背景技术：

SPL(SQUAMOSA-PROMOTERBINDINGPROTEIN-LIKE)是植物特有的一类转录因子，包含一个由78个氨基酸组成的SBP保守结构域。另外，SBP结构域中包含一个DNA结合域，两个锌指结构(Zn-fingers)，以及一个核定位信号(NLS)。鉴于SPL基因在植物发育中的重要作用，研究者已经从越来越多的物种中鉴定出了SPL基因，例如苔藓，拟南芥，苹果，番茄，杨树等。随着测序技术的日益发展，越来越多的物种基因组测序已经完成。基因组分析发现在植物中SPL具有一个相对较大的家族。例如，在拟南芥中存在16个SPL基因，番茄中存在15个SPL基因，杨树中存在28个SPL基因。从金鱼草中分离出的SBP1和SBP2基因是最早发现的SPL基因，由于其能与SQUAMOSA基因的启动子结合而得名，同时还发现他们能参与花分生组织的形成。随后，对拟南芥中SPL的基因功能分析发现，这些SPL基因参与调控植物不同的生长发育过程，包括营养生长向生殖生长的转型、雄性不育、赤霉素(GA) 合成、植物形态建成和环境胁迫应答等。拟南芥中，AtSPL2，AtSPL10和AtSPL11在生殖阶段共同调控侧生器官的发育，而且参与调控茎生叶和花的形态建成。AtSPL3，AtSPL 4和AtSPL 5在控制开花转型上具有类似功能，最近研究表明这三个基因通过SOC1-SPL模型调节光周期和赤霉素信号来控制植物开花。AtSPL9和AtSPL15冗余地调控拟南芥幼年向成年的转型以及叶的形成。另外，AtSPL9还参与调控表皮毛的发育和花青素的合成。最近研究显示，在受miR156调控的10个拟南芥SPL基因中，代表三个不同进化分支的AtSPL3，AtSPL9和 AtSPL10能抑制侧根的生长，其中AtSPL10作用最明显。AtSPL7通过调控COPT6的表达间接调节铜离子内稳态平衡，而且在拟南芥根和顶端分生组织的发育中AtSPL7也发挥重要作用。AtSPL8在拟南芥生殖发育中起着至关重要作用，一方面AtSPL8影响花粉囊的发育，另一方面AtSPL8参与调控赤霉素(GA)介导的开花途径。

发明内容：

本发明提供一种从白桦中克隆白桦转录因子基因BplSPL8的方法；

(1)先采用改良的CTAB法提取白桦雄花RNA，用QuantScript RT Kit合成cDNA第一链

(2)用KOD-PLUS(TOYOBO)对合成的cDNA进行PCR扩增，获得一个SBP转录因子基因的全长cDNA，命名为BplSPL8；

(3)与pENTER载体连接并转化大肠杆菌，参照pENTRE(invegin)，挑阳性克隆提质粒并送华大基因公司测序，取重复性好的序列为目的基因序列，参照kit(invengin)进行LR反应，构建过表达载体。成功构建的过表达载体转化农杆菌，作为转化拟南芥菌株；

PCR扩增产物经测序，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；其编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；

本发明构建了BplSPL8基因的植物表达载体，构建的植物表达载体(pGWB5-BplSPL8)经农杆菌浸染拟南芥(哥伦比亚生态型)植株，获得转基因拟南芥植株，发现短日照条件下，赤霉素敏感性降低，长日照条件下的幼苗叶片内卷，赤霉素诱导叶缘褶皱，主根伸长生长被促进，侧根形成受抑制，幼苗阶段有色素生物合成和次生代谢产物积累，表明该基因是一个多功能调控基因，参与植物不同生长过程的调节控制；

构建BplSPL8基因植物表达载体的技术方案如下：

(1)选择pGWB5载体作为基本植物表达载体，利用CTAB法提取白桦幼叶总RNA，参照kit (TOYOBO)反转录合成cDNA第一链，利用KOD-PLUS(TOYOBO)扩增目的基因，与 pENTR^TM/SD/D-vector载体连接并转化大肠杆菌，挑阳性克隆提质粒并送华大基因公司测序，取重复性好的序列为目的基因序列，参照kit(invengin)进行LR反应，构建过表达载体。引物序列为正向引物：BplSPL8-F：5′-GCTGTCGGGCGAGGAAGA-3，反向引物： BplSPL8-R：5′-TTGAAGGGTTGGGTGTAGGG-3′。