[发明专利]利用荧光显微镜观察桔霉素免疫后牛蛙抗体和亲和的方法

说明书

本发明涉及食品安全检测技术，旨在提供一种利用荧光显微镜观察桔霉素免疫的亲和蛋白的方法。包括：取来自桔霉素抗体免疫组牛蛙和对照组牛蛙的蛋白提取液，各加入桔霉素标准品，混匀后在冰箱中静置；然后分别装入透析袋进行透析；取透析袋内的保留液滴在载玻片中央置于荧光显微镜中；使用蓝绿光激发滤板，分析荧光斑点的大小。本发明以荧光显微镜技术观察桔霉素免疫后的牛蛙血清蛋白和肌肉蛋白的形态，并通过测定荧光斑点面积来鉴定桔霉素结合蛋白。相对于传统的鉴定方法具有快速、准确、直接的特点，对牛蛙抗体和肌肉亲和蛋白的形态观察、桔霉素结合蛋白的快速筛选具有重要的实际意义。

技术领域

本发明依据荧光物质和特异亲和蛋白质之间的吸附原理，利用荧光显微镜观察桔霉素免疫后牛蛙亲和蛋白，属于食品安全检测技术。

背景技术

桔霉素(Citrinin)是一种真菌毒素。桔霉素的分子结构为共轭的平面结构，具有天然的荧光特性。兔子、大鼠、小鼠是常见的制备桔霉素的免疫抗体的动物。为了鉴定抗体蛋白质是否与桔霉素结合，有人利用荧光分光光度计分别对抗体的桔霉素溶液和桔霉素标准溶液进行荧光扫描，通过比较荧光光谱中荧光强度最大发射峰所对应的波长的变化，以此判定抗体是否与桔霉素共价结合。其原理是物质分子上连接的取代基结构对化合物的光学性能会产生较大的影响，使化合物荧光光谱最大发射峰所对应的波长发生变化。这种方法可以判断两者结合能力，但是这种方法无法观察到牛蛙中桔霉素亲和蛋白的形态。目前对于两栖纲动物免疫球蛋白分子的研究主要是以对非洲爪蟾的研究为主。它具有IgM、lgX、IgY和IgD、IgF五类。IgM是爪蟾生活史中最早产生的、最重要的免疫球蛋白。IgX在结构上与IgM类似，以聚合体的形式存在，在功能上类似于哺乳动物的IgA，主要在肠道中表达，在血清中含量很低。IgY在爪蟾生活史中出现较晚。IgD和IgF是最新发现的两种免疫球蛋白分子，IgD仅在脾脏中有微弱表达，结构与其他动物IgD相同；IgF基因组与其他免疫球蛋白分子不同，其重链基因仅具有两个结构，其功能还未有研究。通过电泳分析，蛙类抗体存在两类，分别为低分子量7S和高分子量18S，已有研究证明，蛙类18S抗体类似于人IgM，而关于7S抗体的功能还没有统一的定论。两栖类动物的抗体与哺乳动物的抗体有很大差别，其抗体至今尚未完全清楚。牛蛙抗体更是没有报道。另外医学上存在超敏现象，一般认为是因为某种小分子的半抗原，与体内组织蛋白结合，在体内形成完全抗原，从而诱导抗体的产生。但是一直没有具体哪种组织蛋白的报道，也缺少组织蛋白与半抗原结合的证据。本方法提供了一种直接观察牛蛙抗体蛋白和组织蛋白的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种利用荧光显微镜观察桔霉素免疫的牛蛙亲和蛋白的方法，用于观察亲和蛋白是否与桔霉素结合、结合程度，以及亲和蛋白的形态。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种利用荧光显微镜观察桔霉素免疫的亲和蛋白的方法，其包括以下步骤：

(1)取来自桔霉素抗体免疫组牛蛙和对照组牛蛙的蛋白提取液各1mL，提取液中的蛋白含量为2.4～3.6mg/mL；向提取液中各加入1mL浓度为1.5μg/mL的桔霉素标准品，混匀后在4℃冰箱中静置3h；然后分别装入透析袋，并各加入20mL的0.01M、pH7.4的PBS作为透析液，在4℃冰箱透析13h；

(2)各取10μL透析袋内的保留液，滴在载玻片中央并盖上盖玻片，置于光显微镜中；使用蓝绿光激发滤板490-520nm，显微镜放大倍数为40×10倍，比例尺为100μm；使用Image-Pro Plus 6.0软件分析荧光斑点的大小；