[发明专利]复合物、蛋白质及二者的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种复合物、蛋白质及二者的制备方法。

背景技术

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是以胰岛素相对或绝对不足为特征的代谢性疾病，胰岛素相对或绝对不足引发高血糖，进而导致三大营养物质代谢紊乱，最终影响患者正常生理功能并且引起并发症。全球糖尿病患者与日俱增，预计2030年将达到4.39亿。

胰岛素于1922年开始用于临床，是目前治疗糖尿病的最有效的药物之一。长期以来，胰岛素一直以注射给药为主，胰岛素是I型和中重度II型糖尿病患者每日治疗中不可缺少的药物。由于胰岛素生物半衰期短，糖尿病患者需要终生每日皮下注射胰岛素，长期频繁注射给患者带来很大痛苦和诸多不便，而且长期注射胰岛素还可能产生皮下脂肪萎缩、出现浮肿等，超剂量给药还会引起低血糖休克等多种不良反应。因此，研制开发非注射给药的胰岛素制剂是近年来国内外研究的热点。

但不经特殊的技术处理的普通胰岛素口服制剂生物利用度只有0.1％-0.2％，无临床意义。其主要原因有以下几点：(1)胰岛素是一种肽类激素，其在胃液酸性环境和消化道各种蛋白酶的作用下，极易降解失活；(2)胰岛素分子量为6000左右，且分子间有很强的聚合趋势，从而使其难以通过扩散被胃肠壁的上皮细胞层吸收；(3)存在肝脏首过效应，生物利用度低；(4)制备过程中的胰岛素构象问题。胰岛素的口服给药一直是一个世界性的难题。

因此，开发一种能口服利用度高的，利用胰岛素达到长效降血糖功能的稳定的蛋白质复合物日益成为研究的热点。

同时，提供一种高纯度的，与胰岛素能够形成稳定复合物的蛋白质也尤为重要。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种复合物，以缓解现有技术中存在的利用胰岛素降糖不能实现口服，且时效短的技术问题。

本发明的第二个目的在于提供一种复合物的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供一种蛋白质的制备方法，以缓解现有技术中存在的纯化方法纯化得到的蛋白质纯度低的技术问题。

本发明的第四个目的在于提供一种蛋白质，以缓解现有技术中存在的蛋白质纯度低的技术问题。

本发明提供的一种复合物，包括蛋白质和胰岛素。

进一步地，所述蛋白质是如下(1)、(2)或(3)：

(1)由序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(3)将SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由其衍生的蛋白质。

本发明还提供了一种上述的复合物的制备方法，包括如下步骤：

步骤(a)：将所述蛋白质与所述胰岛素按照摩尔比例1:20-10:1溶于mops缓冲液中，得到混合液，并调整pH至1.7-10.8；

步骤(b)：将所述混合液于25-35℃进行孵育后，充分震荡；

步骤(c)：将经震荡的混合液进行超生波处理；

步骤(d)：冷藏降温过夜。

进一步地，所述步骤(b)中进行孵育的时间为10-30min，震荡的时间为3-10min。

进一步地，所述步骤(d)中超声波处理的时间为1-5min，所述冷藏的温度为4℃。

本发明还提供了上述的蛋白质的制备方法，包括：

调节酵母发酵液的pH至2.0-4.0，放置8-12h后，加热至75-85℃，进行物理脱氧，离心并收集沉淀。

进一步地，所述酵母发酵液为Pichia酵母发酵液。

进一步地，所述物理脱氧的方法为将惰性气体鼓泡入所述Pichia酵母发酵液的内部。

进一步地，所述物理脱氧的时间为2-6h。

另外，本发明还提供了一种蛋白质，应用上述的制备方法制备得到。