[发明专利]转基因针叶树植株的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及针叶树植株的栽培，具体地，涉及转基因针叶树植株的制备方法。

背景技术

在全球森林资源中，针叶树占世界总林分面积的60％(Narender et al，2005)，主要分属南洋杉科(Araucariaceae)、松科(Pinaceae)、杉科(Taxodiaceae)、柏科(Cupressaceae)、罗汉松科(Podocarpaceae)、三尖杉科(Cephalotaxaceae)和红豆杉科(Taxaceae)等，多为高大乔木；在我国森林资源中，针叶树占全国林分总蓄积面积的56.2％，大多分属松科、杉科、柏科等，常形成单纯针叶林或针阔叶混交林。

长期以来，林木遗传转化技术的发展一直滞后于主要农作物及其它草本植物，主要原因是林木生长周期长，受外界环境影响大，再生困难，生根更难。相对于阔叶树来说，针叶树遗传转化难度更大，难点在：⑴组织培养进展缓慢，高效再生系统匮缺；⑵抗生素敏感性高，转化外植体分化频率低；⑶抗性芽生根困难；⑷选择压低，假阳性率高。这些困难严重阻碍了针叶树基因工程研究进展。近年来，尽管不断涌现出有关针叶树遗传转化的报道，但大多数物种尚停留在瞬时表达阶段(Ellis et al.,1991；Hey et al.,1994；Hagman et al.,1997；Hamara et al.,1999；Fernando et al.,2000)。

因此，本领域迫切需要开发一种可有效制备转基因针叶树植株的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可有效制备转基因针叶树植株的方法。

本发明第一方面提供了一种针叶树植物的转基因方法，包括步骤：

(a)对针叶树植物的种子进行萌发处理，从而获得幼苗；

(b)对所述幼苗进行去根处理，从而获得经去根的幼苗；

(c)将所述经去根的幼苗进行培养，获得经培养的幼苗；

(d)对所述经培养的幼苗的下胚轴进行切取，获得下胚轴切段；

(e)将所述的下胚轴切段作为转基因受体材料，进行转基因处理，从而获得转入外源基因的下胚轴切段；和

(f)任选地，对所述转入外源基因的下胚轴切段进行再生，从而获得转基因的针叶树植物植株。

在另一优选例中，在步骤(f)中，包括以下一个或多个独立的子步骤：

(f1)对所述转入外源基因的下胚轴切段，在递增的筛选压力条件下，进行筛选培养，获得抗性愈伤组织；

(f2)对愈伤组织进行出芽处理，从而获得抗性不定芽；

(f3)对抗性不定芽进行生根处理，从而获得转基因的针叶树植物植株。

在另一优选例中，所述的筛选压力是针对抗性基因的筛选压力。

在另一优选例中，在步骤(f1)中，所述的递增的筛选压力包括2、3、4、5、6级的递增筛选压力。

在另一优选例中，所述递增的筛选压力包括3级或4级。

在另一优选例中，在步骤(f1)中，在针对所述述抗性筛选基因的第一(级)筛选压力条件、第二(级)筛选压力条件、第三(级)筛选压力条件下，进行筛选培养，获得抗性愈伤组织。

在另一优选例中，在步骤(f2)中，在单级或递增的筛选压力进行出芽处理。

在另一优选例中，在步骤(f2)中，所述的递增的筛选压力包括2、3、4、5、6级的递增筛选压力。

在另一优选例中，所述递增的筛选压力包括2级、3级或4级。

在另一优选例中，在步骤(f2)中，在针对所述述抗性筛选基因的第一(级)筛选压力条件、第二(级)筛选压力条件下，进行筛选培养，获得抗性愈伤组织。

在另一优选例中，在步骤(f2)中的第一(级)筛选压力与步骤(f1)中的最后一级的筛选压力相当(或相近)或相同。

在另一优选例中，在步骤(f2)中所述单级的筛选压力等同于或高于步骤(f1)中的最后一级的筛选压力(即按抗生素浓度计算，单级的筛选压力与步骤(f1)中的最后一级的筛选压力的比值为0.9-1.3，较佳地0.9-1.2，更佳地1.0-1.2)。

在另一优选例中，在步骤(f3)中，在单级或递增的筛选压力进行生根处理。

在另一优选例中，在步骤(f3)中，所述的递增的筛选压力包括2级的递增筛选压力。

在另一优选例中，在步骤(f3)，在单级的筛选压力进行生根处理。