[发明专利]一种微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法

说明书

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种微斑报春苣苔的组织培养方法。一种微斑报春苣苔的无菌萌发和组织培养方法，包括如下步骤：无菌萌发、初代培养、不定芽增殖培养、愈伤组织分化、生根培养和炼苗移栽。本发明的微斑报春苣苔的组织培养方法具有种子萌发率高、成苗快、种苗品质好等特点，能在短期内获得大量的组培苗，是微斑报春苣苔种苗生产及资源保护的有效途径。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法。

背景技术

微斑报春苣苔(Primulina minutimaculata)为苦苣苔科报春苣苔属的多年生草本植物。分布于广西龙州、天等，生于石山林下石上，海拔200-450m，花期4-5月。微斑报春苣苔在龙州和天等的分布范围虽然较广，但分布零星，且居群小，植株个体数量较少，自身更新困难。此外，由于开山筑路等对生境严重破坏，导致居群迅速退缩，目前已处于濒危状态，IUCN等级为极危。

微斑报春苣苔花型独特，叶片具有魅力的斑纹，观赏价值极高，受到国外众多观赏植物爱好者和育种者的广泛关注，是极具开发利用的喀斯特野生花卉。传统的繁殖以种子播种和叶片扦插为主，但繁殖速度慢，繁殖系数小。而组织培养能够在短时间内获得大量遗传性状一致的优质苗，克服了常规繁殖周期长、繁殖系数小的缺点。

目前，组织培养在报春苣苔属的其他植物上得到了广泛应用，且多以叶片为外植体，而在微斑报春苣苔上的应用尚未有报道。因此，通过微斑报春苣苔的种子无菌萌发进而进行分化培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽，从而建立微斑报春苣苔的组织培养体系，对其规模化生产和种质资源收集及保存具有积极意义。

发明内容

针对现有的微斑报春苣苔人工繁育技术的匮乏与不足，本发明提供一种微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法，该方法具有种子萌发率高、成苗快、种苗品质好等特点，能在短期内获得大量的组培苗，是微斑报春苣苔种苗生产及资源保护的有效途径。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法，包括如下步骤：

(1)种子的无菌萌发：取成熟未开裂的微斑报春苣苔的果荚，用洗洁精浸洗10-15min后在流水下冲洗干净10-15min，在超净工作台上先用75％酒精中浸泡果荚30-40s，无菌水冲洗3-5次，再用0.1％升汞溶液浸泡果荚12-15min，无菌水冲洗3-5次，在接种盘上切开果荚，并用经过消毒灭菌的勺子轻轻将种子拨入种子萌发培养基中，播种好的种子先在光照培养箱中暗培养至种子萌发，然后再转入培养室中光培养；所述的0.1％升汞溶液中加入有吐温-20，每100mL0.1％升汞溶液中加入2滴吐温-20；

(2)初代培养：将已经萌发子叶但尚未长出真叶的小苗切成子叶、胚轴两部分，然后接入不同的初代培养基中；子叶28-32d可直接诱导出不定芽，并且在子叶基部有愈伤组织产生；胚轴30d能诱导愈伤组织；

(3)不定芽的增殖培养：将具有1对以上叶片的不定芽切取下来，接入增殖培养基中培养26-28d；

(4)愈伤组织的分化培养：将愈伤组织切成1cm×1cm的小块接入分化培养基中培养29-30d；

(5)生根培养：当组培芽具有2对以上叶片时，转接于生根培养基中培养23-25d；

(6)炼苗移栽：将具有2-3对叶片的生根苗移出培养室，在温室中炼苗10-14d；洗净培养基移栽到装有基质的50孔穴盘中，浇透定根水后，将移栽小苗置于有遮阳网的荫棚下，透光率为40-50％，移栽7d后，用1/2MS营养液浇淋，连续淋2次，时间间隔为7d，移栽后20d后统计成活率。

作为优选，步骤(1)中所述的暗培养的温度为17-20℃；所述的光培养温度23-25℃，光照为1000-1400lx。