[发明专利]一种微小核糖核酸122探针及其制备方法

说明书

本发明涉及一种微小核糖核酸122探针及其制备方法，该探针由三部分组成：miR‑122、连接基团以及适用于点击化学反应的叠氮基团，以上组合得到的探针在肝细胞内并不影响miR‑122本身的功能，在其与靶基因结合后通过点击化学反应修饰亲和基团，进而实现miR‑122靶基因的富集及检测，通过以上分析将揭示miR‑122在正常肝细胞及肝癌细胞内的miR‑122调控网络，为miR‑122在肝癌发病进程中的分子机制提供新的解释。本发明相比于传统的生物化学方法，具有特异性高、操作简便、成本低、适合推广等优势。本发明的技术方案提供一种可方便对微小核糖核酸122及其下游靶基因的标记、分离及鉴定的微小核糖核酸122探针及其制备方法。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种微小核糖核酸122探针及其制备方法。

背景技术

微小核糖核酸是内源性的小分子核糖核酸，其可以在转录后水平负调控基因的表达。近年来的研究已经发现，微小核糖核酸的异常表达或功能均会引起下游原癌或抑癌基因的紊乱，从而诱发或促进疾病的发生发展。因而，微小核糖核酸与包括癌症在内的众多疾病的发生发展密切相关，这也极大地推动了将微小核糖核酸作为疾病诊断治疗的生物靶标，尤其是近年来包括let-7、微小核糖核酸-34在内的一些微小核糖核酸已经成功进入到了临床研究中，表明了微小核糖核酸在临床应用中的巨大潜力。微小核糖核酸-122是肝特异性的微小核糖核酸，在正常肝细胞和组织中表达水平较高，但在肝癌细胞及组织中表达水平显著降低。已有一些证据显示微小核糖核酸-122与肝癌的发生发展有着密切的关系，而且在肝癌细胞中恢复微小核糖核酸-122的表达可以促进肝癌细胞的凋亡，然而治疗效果仍然差强人意，这在很大程度上由于微小核糖核酸-122在正常肝细胞及肝癌细胞中的调控网络目前仍然不明，单纯地恢复微小核糖核酸-122的表达并不能从根本上逆转肝癌的发展进程，因而目前急需了解肝细胞中微小核糖核酸-122的调控网络，了解肝癌发病进程中微小核糖核酸-122的分子机制。

然而，微小核糖核酸靶基因的鉴定一直是当下微小核糖核酸研究及治疗中的难点，目前依赖的方法主要为：(1)生物信息学预测；(2)免疫共沉淀微小核糖核酸相关功能蛋白，对功能蛋白中微小核糖核酸的靶基因进行鉴定，再结合生物信息学的方法解析；(3)在微小核糖核酸的3’末端标记生物素基团，利用生物素与链霉素之间的亲和作用对细胞内与微小核糖核酸相互作用的靶基因进行分离鉴定。这几类方法中，只有第三种方法可以高通量地对微小核糖核酸的靶基因进行直接地分离鉴定，但是近来的研究也发现在微小核糖核酸的3’末端直接修饰生物素可造成微小核糖核酸功能丧失，这就提示急需发展一类可代替生物素的基团以用于微小核糖核酸-122的标记。

发明内容

本发明目的是为了克服现有技术的不足而提供一种可方便对微小核糖核酸122及其下游靶基因的标记、分离及鉴定的微小核糖核酸122探针及其制备方法。

为达到上述目的，本发明采用了如下技术方案。

本发明提供一种微小核糖核酸122探针，其化学结构如下：

其中:X是酰胺键；R1-R8均是氢；n＝1。

该微小核糖核酸122探针的制备方法，具体包括如下化学反应后得到：

荧光素酶实验：

通过miR-122探针刺激肝癌细胞内的荧光素酶信号变化判断其生物活性，具体流程如下：

(1)构建含有miR-122结合位点的荧光素酶质粒；

(2)将质粒和miR-122探针共转染到肝癌细胞中；

(3)测定荧光素酶信号。

拉下实验：