[发明专利]人工合成的对鳞翅目害虫高毒力杀虫基因及应用

说明书

本发明为“人工合成的对鳞翅目害虫高毒力杀虫基因及应用”，属生物防治技术领域。本发明提供的对鳞翅目害虫具有高毒力的mcry2Ah基因、mcry2Ah‑vp基因和mcry2Ah‑sp基因的人工优化、改造并合成的新的DNA序列(见SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4)，利用植物偏好的密码子序列，可以提高mcry2Ah基因、mcry2Ah‑vp基因和mcry2Ah‑sp基因在转基因植物中的表达量和稳定表达的特性，mcry2Ah‑sp表现出对抗性鳞翅目害虫的抗虫性高于其他改造基因，可以利用该基因序列转化植物防治害虫和延缓害虫抗性产生。

技术领域

本发明属于生物防治技术领域，特别是涉及人工合成的对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因基因序列及其应用。

背景技术

虫害是世界农作物减产的一个重要因素，平均每年因此损失粮食总产量的10％左右，直接经济损失达100亿美元以上。过去几十年的防治主要依赖化学农药，在为农业生产做出巨大贡献的同时，化学农药却造成了环境污染、人畜中毒、生态失衡等严重后果。在这些巨大的代价面前，全球都在寻找和开辟新的病虫害防治策略和技术。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种分布极其广泛的革兰氏阳性细菌。它在形成芽胞的同时，能产生蛋白性质的伴胞晶体(parasporal crystal)，对鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多种昆虫，以及线虫、螨类和原生动物具有特异性的杀虫活性(Schnepf E.et al,1998,Microbiology andMolecular Biology Review,62(3):775-806)。这种杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins,ICPs)又称δ-内毒素(Delta-endotoxin)，在昆虫中肠首先溶解，成为原毒素，之后被肠道蛋白酶降解为具有专一活性的毒素，与中肠上特异的受体进行结合(Craig,2007,Microbiology and Molecular Biology Review,71(2):255–281)，导致昆虫死亡，苏云金芽胞杆菌对人畜无害，不污染环境，因而Bt在害虫的生物防治中得到了广泛应用。

目前人们已经克隆了825种编码杀虫晶体蛋白的Bt杀虫基因，它们分属318种模式基因(可参见http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt//holo2.html)。

1987年，Vaeck等人首次将Bt杀虫晶体蛋白基因转入烟草，开创了人类利用转基因技术防治害虫的先河(Vaeck et al,1987，Nature,328:33-37)。但是在转基因研究中人们发现将来源于Bt的杀虫蛋白基因直接转入植物，存在着表达产物不稳定、表达量少的缺陷(van Aarssen et al,1995,Plant Molecular Biology,28:513-524)。具体问题包括：1)天然Bt基因高含AT，超过60％，在植物体内这样的基因表达的mRNA极易被植物降解；2)天然Bt基因中存在类似真核基因的内含子切点、转录终止子序列，从而造成转录不完整、mRNA异常剪切等；3)天然Bt基因中使用的密码子与植物存在较大差异，会造成蛋白翻译效率降低；4)天然Bt基因作为原核生物来源的基因，其结构与植物等真核生物差异显著，如真核生物含有5’-UTR序列，3’末端的polyA尾序列。因此，这些关键问题的解决是实现Bt基因在植物中高效、稳定表达的重要保证。随着这些技术的改进和完善，自1996年以来的二十年内，转基因抗虫玉米、马铃薯、水稻等作物相继研制成功，并逐步进入应用阶段(James C，ISAAABriefs，2016)。