[发明专利]特异性识别c‑Myc标签纳米抗体的免疫亲和吸附材料在审

专利信息
申请号: 201710100437.6 申请日: 2017-02-23
公开(公告)号: CN107051397A 公开(公告)日: 2017-08-18
发明(设计)人: 李燕萍;涂追;付金衡;许杨 申请(专利权)人: 南昌大学
主分类号: B01J20/24 分类号: B01J20/24;B01J20/28;B01D15/38;B01D15/20;G01N33/53
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摘要:
搜索关键词: 特异性 识别 myc 标签 纳米 抗体 免疫 亲和 吸附 材料
【说明书】:

技术领域

发明涉及一种基于单域重链抗体(又称纳米抗体技术)的免疫亲和 吸附材料,特别是针对c-Myc标签的免疫亲和吸附材料。

技术背景

c-Myc标签蛋白的发现源于1985年Evan制备获得了一株针对人原癌 基因产物Myc蛋白的单克隆抗体9E10,此后研究发现该抗体识别的表位由 10个氨基酸残基组成,其序列为Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp -Leu,并且这10个氨基酸与其它蛋白融合表达后依然能够保持很强的抗 原活性,可以被相应抗体识别,而且不受到蛋白框架的影响。因此,c-Myc 标签系统广泛应用于免疫学检测、细胞成像、亲和纯化以及蛋白质工程等 领域。

免疫亲和层析、免疫亲和磁珠及免疫共沉淀等技术常用于分离纯化含 有c-Myc标签融合蛋白。这类亲和纯化技术基于配基与c-Myc标签特异性 结合的原理,一般地,将特异性结合c-Myc标签的配基与载体偶联或吸附, 然后用于从溶液中特异性吸附c-Myc标签融合蛋白。

市场上针对c-Myc标签融合蛋白纯化用的亲和柱和亲和磁珠,偶联的 配基大都是单克隆抗体或多克隆抗体。单克隆抗体的研发和生产过程较为 繁琐和复杂,多克隆抗体来源有限。现有的针对c-Myc标签融合蛋白纯化 的亲和柱和亲和磁珠价格普遍偏高。而纳米抗体可以在大肠杆菌、酵母等 生物中大量表达,有利于降低相关制品的生产成本。

蛋白纯化过程中需要用到酸或碱性溶液对目的蛋白进行洗脱。由于单 克隆抗体或多克隆抗体由重链和轻链组成,酸碱洗脱会不可避免的导致抗 体活性降低,因而不能重复使用。相比之下,单域重链抗体仅由一个结构 域组成,具有耐酸碱、耐高温。本发明中提供的亲和吸附材料可重复多次 使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对c-Myc标签的免疫亲和吸附材料及其应 用。

为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:

针对c-Myc标签的免疫亲和吸附材料包括载体和配基,所述配基为单 域重链抗体,具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。该配基可特异性识 别c-Myc标签。

所述配基还可以为在前述单域重链抗体基础上通过随机或定点突变 技术进行改造所获得的能与c-Myc标签特异性结合的抗体。

所述载体为磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球或多孔材料。

上述c-Myc标签免疫亲和吸附材料的制备方法,其特征为:

所述载体为磁珠时,制备方法为:取1mg羧基磁珠于离心管中,加 入600~1000μl活化缓冲液(10mM,NaH2PO4,pH 6.0),涡旋混合均 匀,磁力架回收磁珠,再用活化缓冲液洗涤2遍。分别加入1~5mg碳 二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),涡旋混合后,静置35min。 用偶联缓冲液(10mM,Na2HPO4,pH 7.4)洗涤磁珠5遍,加入抗c-Myc 标签单域重链抗体,室温反应3~5h,得到共价偶联了抗c-Myc标签单 域重链抗体的免疫磁珠;

所述载体为琼脂糖凝胶微球时,制备方法为:将CNBr活化的干胶用 0.1M HCl洗涤10~20次,每次平衡6~10min。用偶联缓冲液(10mM, Na2HPO4,pH 7.2)洗涤5~20次,加入抗c-Myc标签单域重链抗体,室 温反应3~10h,得到共价偶联了抗c-Myc标签单域重链抗体的免疫亲和 吸附材料;

所述载体为硅胶微球时,制备方法为:将硅胶微球用纯水和磷酸缓冲 液(PBS,10mM,pH 6.5)交替洗涤5~15次,用PBS缓冲液悬浮硅胶微 球,加入抗c-Myc标签单域重链抗体,混匀,加入终浓度1~10mg/ml的 碳二亚胺(EDC),迅速混匀,4℃搅拌反应12~20h,得到共价偶联了抗 c-Myc标签单域重链抗体的免疫亲和吸附材料。

将上述免疫亲和吸附材料(载体为琼脂糖凝胶微球和硅胶微球)装填 至层析柱,即得到c-Myc标签免疫亲和层析柱,方法为:根据层析柱容量, 取适量上述免疫亲和吸附材料于层析柱,加入8~10倍柱床体积的PBS(10 mM,pH 7.2)洗涤后,4℃,保存于20%乙醇溶液。

本发明还涉及装载有权利要求1所述c-Myc标签免疫亲和吸附材料的 亲和层析柱。

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